DNA
• DNA (Desoxyribonucleinsäure): kettenförmiges Makromolekül, dessen Baueinheiten man als Nucleotide beyeichnet
• Nucleotid: besteht aus einer Phosphatgruppe, dem Zucker Desoxyribose und einer stickstoffhaltigen Base
—> Purinbasen: Adenin und Guanin; Pyrimidinbasen: Cytosin und Thymin
• Nucleotide bilden in der DNA einen Polynucleotidstrang
·
am 3'-Ende ist das 3. (-Atemd. Zuckers mit keiner phos-
-s
52
P
Desoxynibose
verbunden
P
: B
phatgruppe
j
5'-Ende liegt 5. C-Atom d. Zuckers eine Phosphat-
:
am am
vor
gruppe
• ein DNA-Molekül besteht aus zwei Polynucleotidsträngen
—> ein Strang verläuft vom 5´-Ende zum 3´-Ende; der Andere andersherum
——> antiparallel/gegenläufig (komplementäre Basenpaarung: Adenin & Thymin; Guanin & Cytosin)
• Basen sind mit Wasserstoffbrückenbindungen verbunden: Bei A/T-Paar 2 WSB, bei G/C-Paar 3
• DNA gleicht in sich gedrehte Strickleiter: DNA-Doppelhelix
• Neben DNA, gibt es auch RNA (Ribonucleinsäure)
—> einzelsträngig und besteht aus weniger Nucleotiden; Zucker ist Ribose & besitzt anstelle von Thymin Uracil
Replikation/Verdopplung d. Erbmaterials
• semikonservativer Mechanismus: eine Hälfte der neuen DNA stammt von der ursprünglichen DNA; eine Hälfte wird neu
erstellt
DNA Mitose
Zellteilung (Meiosel erstauchganzlinie eine
Replikation
-
->
Bildung homologer Chromosomen;11 22
+
mithilfe versch. bes.
Enzyme; DNA-Polymerase
·
·blanaisomerenmitrot brüchen-Replikation
7
gelesen
setzt Einzelstränge
7
an DNA an
3. Primase synthetisiert Primer -
- ·ralmanachintreterStachtetnranseine
Ghazahi Fragmente, mehrer Primer notwendig
Frage
7.
abgebaut:gase verkrpft
Primer entymarsch
• schraubenförmige DNA muss zuerst entwunden & aufgetrennt werden (wie Öffnung eines Reißverschlusses)
• Die beiden offengelegen Einzelstränge stellen eine Vorlage für jeweils einen neu herzustellenden Strang dar
• An jeder aufgetrennten Base kann sich ein DNA-Baustein (das Nukleotid) mit der passenden Base anlagern
Initiation (erste Phase)
• Replikation startet an definierten Stellen (Replikationsursprüngen)
• Enzym Topoisomerase entspiralisiert helixförmigen Doppelstrang
—> von Schraubenform in Strickleiterform
• um Einzelstränge zu erhalten: Wasserstoffbrückenbbindungen zwischen den Baasenpaaren müssen getrennt werden
—> Helikase
• eine Y-förmige Stelle entsteht: Replikationsgabel
• Von jedem Replikationsursprung aus wandert je eine Gabel nach Rechts & eine nach Links
• Um getrennten Stränge zu stabilisieren, binden sich spezielle Proteine an die jeweiligen Abschnitte
• Damit Verdopplung beginnen kann, werden Startmoleküle benötigt: Primer (werden von Primase hergestellt)
—> kurzes RNA-Stück, das an das 3´-Ende der Einzelstränge angebracht wird
Elongation (Synthese neuer Einzelsträünge)
—> RNA-Polymerase: fügt neue Nukleotide an die Primer an (immer an 3´-Ende, da nur dort Verknüpfungen stattfinden kann)
——> arbeitet also von 5´- 3´-Richtung
• beide Einzelstränge verlaufen antiparallel
—> daher: Leitstrang ist so orientiert, dass er ohne Unterbrechung verlängert werden kann
• Polymerase arbeitet in gleiche Richtung wie Helikase —> kontinuierliche Verlängerung
• Folgestrang so angeordnet, dass sich sein 3´-Ende von der Replikationsgabel entfernt & eine immer größere Lücke entsteht
—> als Lösung: Primase fügt immer wieder Primer an den Folgestrang an —> kurze DNA-Abschnitte = Okazaki-Fragmente
——> dadurch kann Polymerase so lange neue Nukleotide an das Primer-Ende anlagern, bis sie den Primer des vorherigen
Abschnitts erreicht hat (diskontinuierliche Verlängerung)
• Ligase schließt Lücken zwischen Okazaki-Fragmenten
,PCR (Polymerasekettenreaktion/Polymerase-Chain-Reaction)
—> um gewünschte DNA-Abschnitte im Labor gezielt zu vervielfältigen
——> oft ist nicht genug DNA-Material vorhanden (wie bei Kriminalistik; erkennen bestimmter Virusinfektionen, etc.)
• ähnelt der DNA-Replikation
• DNA-Polymerase sorgt für das Aufbauen der DNA-Stränge, indem sie Nucleotide aneinanderlagert & miteinander verbindet
• Mind. 20 Zyklen durchlaufen, um gewünschte DNA-Menge zu erhalten
• ,,Zutaten‘‘: DNA, Primer (künstlich hergestellte Startmoleküle), Nucleotide (A, G, T, C), DNA-Polymerasen (aus thermophilen
Bakterien oder Archaeen), Themocycler (für Temp.)
Denaturierung
—> DNA in Einzelstränge
• auf ca. 90°C erhitzen
—> Wasserstoffbrückenbindungen trennen sich
• aus 1 Doppelstrang 2 Einzelstränge
—> Vorlage für ihre Vervielfältigung
Primerhybridisierung
—> Primer an 3´Ende
• abkühlen auf ca. 60°C
• Primer können an Vorlagestränge binden
• Komplementäre Basenpaarung
Amplifikation (Vervielfältigung)/Polymerisation
—> Polymerase synthetisiert neuen Strang in 3´->5´Richtung
• erhitzen auf ca. 70°C
—> optimale Arbeitstemp. Der DNA-Polymerase
• beginnt an zuvor eingesetzten Primern ihre Arbeit
—> lagert am Ende der passenden Primer passende Nukleotidbausteine an & verknüpfen sie
——> zum Vorlagestrang passende DNA-Sequenz bildet sich
• Schritt 1 beginnt erneut, um beide Doppelstränge zu trennen
• Trennen & identifizieren der Abschnitte —> mit Agarose Gelelektrophorese
Gelelektrophorese
—> Auftrennen DNA Fragmente; DNA neg. Geladen —> läuft durch Gel zu Anode; je kleiner, desto leichter —> große DNA
Fragmente oben; kleine unten
DNA-Sequnzierung
—> um DNA Sequenz bestimmen zu können; folgt Schritten PCR-Anwendung Abbruchnukleotide, somit verschieden lange
Fragmente, durch Gelelektrophorese identifizierbar, an welchen Stellen welche Base —> Basensequenz ermitteln
Genetischer Fingerabdruck
—> mit short tandem repeats, bei jedem Menschn verschieden häufig wiederholt; mit Restriktionsenzymen rausgeschnitten,
Auftrennung Gelelektrophorese —> Vergleich Muster verschiedene Personen auf Ähnlichkeit —> z.B. Kriminalfälle,
Vaterschaftstest
, ~
!!! I !!!!!!!!
·
·
Analyse ver fahren.
Schema
. Definition überblick
Auftrennung Moleküle (z.B. DNA) elektrischen Feld.
geladener im
·
·Die Wandergeschwindigkeit hängt von der Masse ab (kleine wander schneller
und ihrer Ladung.
·
Wanderrichtung der negativ geladenen DNA:Vom
zum er
Identifikationsaspekt
Authau S
·
An welcher Stelle sich die gesammelt hat, Charakteristische
DNA Bandenmuster
·
Basis:Behältnis mit Gel-Matrix ( Substanz, durch die Moleküle
Wandern) Ablauf
(- ArtSiebwirkung" für Molellel Gemisch mit Molekülen - diese nichtsichtbar sind:mitFarbstoffeinfärben
·
↳ darin:Poren haben eine wenn
auf Gel geben
↳ Unterschied bei den Gelarten (z.B. Agarose Gel groen Gemisch
·
mit
-
Richtung.Anode
in
Poren) Molekülewandern: Anionen
Poren VS. Polyacrylamid-Gel mir kleinen
·
in Richtung...
Stromregler (- erzeugt
.
elektisches Feld) -Kathionen Kathode
↳ Gröe & wandern Moleküle unterschiedlich weit
geladen (Kathodel Ladung
↳ Bereich wird dadurch negativ nach
ein je
↳ein Teil positiv (*Anodel ↳
kleine Moleküle wandem schneller als groe
·
durch die Poren & Reibung auf Geloberfläche setzen sich Moleküle ä hnlichen
mit
Nutzen Eigenschaften an derselben Stelle ab
·
Untersuchung von vorher:Verfielfältigung d. Proben
DNA ↳ Moleküle mit gleicher Groe & Ladung in Banden ab
mithilfe PCR ↳ Bandenmuster sichtbar (Farbstoff verwendet:Verwendung von UV-Licht)
↳ für Kriminalfälle Aussagen über Bandenmuster, indem Marker (=Referenzmolekülel hinzufügt,
3
man
·
genetischer Fingerabdruck
↳ Vaterschaftstests dessen Eigenschaften bekannts ind
↳ neues Bandenmuster VS. Bandenmuster d. Marker
