Uitleg van moleculaire technieken van het vak Genoom Deel 2: van alle besproken DNA, RNA en eiwit-analyse technieken wordt de werking en de interpretatie van de resultaten van de techniek tot in detail besproken. De informatie uit hoorcolleges, werkcolleges, practica en Labstermodules zijn allemaal...
** Alle afbeeldingen uit deze weergave komen uit bronnen van het UMC Utrecht **
Week 7
HC Technieken: DNA, RNA
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces in de cel (= in levende omgeving): in vivo
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces uit de cel halen en bestuderen in een reageerbuis: in vitro
Basisprincipe in veel DNA/RNA-analysetechnieken is hybridisatie.
1. Denaturatie: dubbelstrengs enkelstrengs DNA of RNA
2. Renaturatie: enkelstrengs dubbelstrengs DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
3. Gebruik van primer/probe/oligo: enkelstrengs DNA voor detectie van complementair gebied
a. 20 nt is uniek
DNA-analyse
PCR
Twee doelen:
1) Selecteren van een sequentie
2) Amplificeren van een sequentie
Proces:
Selecteren specifieke, dubbelstrengse sequentie en heel vaak amplificeren. Uit elkaar halen strengen door
hele hoge temperatuur. Daarna gebruik van 2 primers: forward en reverse primer, dezelfde sequentie maar
ene is in spiegelbeeld van 3’ naar 5’. Primers binden aan 3’ van target sequentie (3’ 5’): daarna m.b.v.
DNA-polymerase repliceren sequentie; de primer bevindt zich dus in de geamplificeerde sequentie. Na 1 e
paar cycli 2 dubbelstrengs DNA-moleculen die de sequentie bevatten, zijn geproduceerd. Uiteindelijk ook
productie van DNA-fragment van alleen specifieke sequentie, die daarna weer wordt geamplificeerd: zorgt
voor exponentiële toename.
PCR primers: complementair, specifiek en binden aan de grenzen van het DNA-fragment van interesse.
Benodigdheden voor PCR:
- Primers
- Nucleotiden
- DNA-polymerase
- DNA template
- Thermocycler: PCR machine
,Voorwaarden voor uitvoeren PCR:
- De uiteinden van het te vermeerderen stuk moeten bekend zijn
- Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn (tussen start en stop)
Restrictie-enzymen (endonucleases)
- Restrictie-enzym herkent sequentie in dsDNA
(dubbelstreng)
- Herkenning meestal via een symmetrische
sequentie
- Enzymen binden vaak als dimeer
o Verschil lineair en circulair DNA
Lineair DNA:
1x knippen = 2 fragmenten
2x knippen = 3 fragmenten
Circulair DNA:
1x knippen = 1 fragment
2x knippen = 2 fragmenten
- Door restrictie-enzymen kunnen er verschillende soorten uiteinden van de breuk ontstaan:
o Sticky 5’ end: overhang
o Sticky 3’ end: overhang (EcoRi, Hindlll)
o Blunt ends (Haelll): d.w.z. stomp, zowel het forward als reverse DNA-uiteinde zijn even lang
DNA-gelelectroforese
- Scheiding DNA-fragmenten op basis van grootte
o Gel werkt als een soort zeef/net
- Het patroon van DNA-fragmenten wordt de DNA-ladder genoemd
- Door een marker toe te voegen in 1 van de openingen, waar fragmenten van verschillende grootte
in zitten waarvan de grootte bekend is, creëer je een referentie: zo kun je de onbekende grootte van
de fragmenten afleiden door te kijken naar de plaats t.o.v. de marker in de gel
- Fragmenten migreren van – naar + pool
o DNA is negatief geladen
- Kleinste (in grootte) fragmenten migreren het snelste naar + pool
- DNA-fragmenten zijn net als gel bijna doorzichtig: DNA zichtbaar maken in gel m.b.v.:
o Ethiumbrome en UV-licht
o Radioactief 32P-gelabelde nucleotiden
o Fluorescent gelabelde nucleotiden
Radioactief en fluorescent labelen zie Sanger sequencing
Dideoxy (Sanger) sequencing
Begin met PCR-reactie: DNA-fragment amplificeren
Verdelen over 4 reageerbuisjes en aan elk van de buisjes kleine hoeveelheid van 1 soort ddNTP toevoegen:
ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP = dideoxy d.w.z. i.p.v. OH, H-groep
In reageerbuisje vindt polymerase plaats van nieuwe DNA-fragmenten: als bij de polymerisatie door DNA-
polymerase i.p.v. dATP, een ddATP wordt ingebouwd, stop de verlenging van de DNA-streng: er kunnen
geen nieuwe nucleotiden meer worden ingebouwd. Door middel van gelelectroforese worden de
verschillende lengten DNA-fragmenten die hierdoor ontstaan van elkaar gescheiden.
- Zichtbaar maken DNA-fragmenten in gel bij Dideoxy sequencing door fluorescentie of radioactiviteit
o Ieder ddNTP heeft een eigen fluorescerende kleur
- Verhouding dNTP/ddNTP is belangrijk
, RNA-analyse
DNA/RNA-analyse o.b.v. hybridisatie + fluorescentie
- FISH: fluorescentie-in-situ-hybridisatie
o Om locatie van DNA-sequenties op mitotische chromosomen zichtbaar te maken
- In-situ hybridisatie
o Om aanwezigheid van specifieke RNA’s in bepaalde weefsels zichtbaar te maken (bijv.
muizenhersenen)
cDNA maken
Met behulp van reverse transcriptase en poly-T-primer: alle mRNA’s omzetten in dubbelstrengs DNA
- Poly-T-primer: alleen mRNA’s hebben een poly-A-staart, binden A-staart met T-primer
- Functies poly-T-primer:
o Startpunt voor reverse transcriptase ( primer)
o Alleen dubbelstrengs maken mRNA’s: andere soorten RNA hebben geen poly-A-staart
(herkenning mRNA’s)
Welke cDNA’s dit oplevert, is dus afhankelijk van de aanwezige mRNA’s: dit is dus variabel per weefsel en
conditie (momentopname)
Kwantitatieve RT-PCR
RT: reverse transcriptase
Via PCR bepalen of een bepaald mRNA heel veel of juist heel weinig aanwezig was in de cel. Meten van
de fluorescentie tegen de tijd (aantal PCR-cycli en dus amplificatie van sequentie)
- Naarmate hoeveelheid dsDNA-fragmenten stijft, neemt de fluorescentie toe
- Hoe hoger de concentratie van een specifiek mRNA bij aanvang, hoe minder cycli er nodig zijn om
de maximale fluorescentie te bereiken
- Aantal benodigde cycli is een maat voor hoeveelheid mRNA
Efficiëntie van de technieken
Elk van deze analysetechnieken heeft zijn beperkingen: het doel is om de aanwezigheid van een sequentie,
de sequentie zelf, de hoeveelheid en de locatie van de sequentie te bepalen.
DNA:
1. PCR: aanwezigheid
2. Restrictie-enzymen: aanwezigheid
3. DNA-gelectroforese: aanwezigheid
4. Sanger sequencing (dideoxy): sequentie
5. Next generation sequencing (tijdens WC): sequentie
RNA:
1. (in-situ) hybridisatie: aanwezigheid, locatie
2. cDNA maken: aanwezigheid, sequentie (na sequencing)
3. Kwantitatieve RT-PCR: hoeveelheid
4. RNA-sequencing (RNAseq) (week 9): aanwezigheid/hoeveelheid/sequentie
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller michelleweesie. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for $4.88. You're not tied to anything after your purchase.
