Tema 11 – Técnicas de Selección, Caracterización e Identificación
Un extracto celular se puede separar por técnicas selectivas basadas en: Densidad, tamaño y
complejidad, sus caracterísitcas fisiológicas, y por la composición y carga de de su superficie de membrana.
DENSIDAD, TAMAÑO Y COMPLEJIDAD ESTRUCTURAL
· Centrifugación en gradiente de densidad: La columna o medio posee un gradiente de densidad, que
permite a las células sedimentar según su propia densidad formando estratos. Para generar un gradiente
continuo, se requiere el uso de centrífugas que permitan regular la inclinación de los cabezales. El medio
debe no ser viscoso a elevada densidad, no tóxico y que ejerza poca presión osmótica. De hecho, la
separación debe ser en condiciones fisiológicas (hipo o hiperosmóticas alteraría la densidad celular).
La densidad (D) y el volumen (V) final de las preparaciones se calcula con la fórmula:
V final · D final = V medio · D medio + V NaCl · D NaCl
Algunos medios son albúmina, dextrano (alta viscosidad,
presión osmótica creciente), ficoll (baja presión osmótica
creciente, alta viscosidad), percoll (SiO 2) , metrizamida (baja
viscosidad, isotónica hasta 20%)... en gradientes de 1'01 a 1'10
g/cc, y 290 mosmol/kg.
El percoll se compone de partículas de sílice (20-30 nm) que
se usan para realizar gradientes de densidad. Se trata del medio
más usado, por ser poco viscoso y de baja osmolaridad
constante. A pesar de esto, su uso para separación de gametos
es discutido debido a la posibilidad de integrarse en la célula y
producir alternaciones en el ADN. La osmolaridad del percolles
dependiente del medio en el que se diluye. En sacarosa, su
fuerza iónica es menor que con NaCl. Por ejemplo, se usa para
separar fibroblastos (densidad 1'04-1'05g/cc) de células HeLa
(1'07-1'08 g/cc).
· Elutriación: Al sistema en centrifugación se le añade un flujo
centrípeto de medio en dirección contraria a la centrífuga. Las
células se separarán según su tamaño y densidad. Cuando los
frentes de avance están bien diferenciados, se extraen las
fracciones mediante aumento del flujo (sin parar la centrífuga). Por
ejemplo, este sistema se usa para separar linfocitos de monocitos
usando percoll como fluido de desplazamiento.
Estos sistemas se utilizan en aplicaciones como separación de esperamatozoides, pudiendo mejorar la
viabilidad eliminando esperma muerto y contaminación, o incluso para separarlos según su contenido
cromosómico (X o Y). Otras aplicaciones son la separación de HSC (stem cells hematopoyéticas) a partir de
médula ósea o sangre de cordón umbilical (densidad 1'06-1'08 g/cc). Las stem cells aparecerán con la
mayoría de glóbulos blancos, de modo que se necesitarían métodos más específicos para separarlas
(<0'005%) de estos.
· Dielectroforésis (DEP): Cuando una célula se encuentra en un campo eléctrico, su tamaño determina su
conductividad y permitividad (la célula se convierte en un dipolo). Cuando el campo eléctrico no es
homogéneo, y cambia a una determinada frecuencia (10KHz-100MHz), la separación es más precisa, y en
este caso el tamaño ya no influirá tanto en el balance de cargas como la composición de su superficie,
permitiendo la diferenciación de células de tamaño similar. A frecuencias bajas (1-10Mhz), el
comportamiento depende de los factores como proteínas de membrana, tamaño y conductividad y
permitividad del medio.
, La impedancia es una medida directa de la respuesta de una suspensión celular al campo eléctrico, y
permite caracterizarla (número y tipo celular) si se cuenta con tablas de calibración.
En la fórmula observamos que el desplazamiento de la partícula depende de la conductividad de la
célula respecto al medio (entre corchetes), del radio celular (a), del campo eléctrico (Erms) y de la
permitividad (ε).
Si la constante K (lo que está entre corchetes) < 1, la célula se desplazará hacia zonas de bajo campo
eléctrico. Si K > 1, se desplazará hacia zonas de elevado campo eléctrico. Diferentes frecuencias provocarán
diferente grado de separación. Se debe estudiar, por tanto, la frecuencia más adecuada para obtener un
factor de enriquecimiento mayor, es decir, mejor separación. La suspensión celular se introduce en un
capilar junto con un medio de desplazamiento y se somete, durante los 15-20 centímetros de longitud, a un
campo eléctrico heterogéneo, creando diferentes frentes de avance que podrán ser recogidos
distintamente.
Por ejemplo, es un sistema muy usado para identificar células cancerígenas viajeras por sangre, posibles
causantes de metástasis.
CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS Y COMPOSICIÓN
· Citometría de flujo: Se basa en la identificación celular mediante un haz
lumínico, que incide en una célula desde delante (forward scatter, para determinar
tamaño) o perpendicularmente (side scatter, para determinar complejidad). Con esta
información, se crean unos gráficos 2D tamaño vs. complejidad (aparte del conteo)
para identificar diversos tipos celulares. Por ejemplo, los glóbulos rojos poseen
escaso tamaño y complejidad, pudiendo diferenciarlos claramente de granulocitos,
cuyo tamaño y complejidad es mucho mayor.
El sistema se basa en la dinámica de microfluídos. En un capilar menor de un
milímetro se introducen dos fluidos: la suspensión celular y un medio envolvente.
Debido a temas físicos y tal, estos dos fluidos no se mezclan, concurriendo a la vez.
Aumentando el flujo del medio envolvente, podemos reducir el caudal de suspensión
celular, de modo que las células pasen individualmente por delante del láser.
Dependiendo de la información que recibe el sistema, es posible dirigir las células
por diferentes caminos mediante acción de un electroimán.
Otro sistema de citometría se basa en el marcaje selectivo. Marcadores como el yoduro de propidio, TO-
PR3 o 7-AAD se unen al ADN de células muertas, sirviendo para determinar la viabilidad de la suspensión.
Marcadores como DAPI o Hoechst se unen al ADN y permiten la separación según la fase del ciclo celular
(2n). CDy-1 se utiliza para el marcaje de stem cells embrionarias e inducidas. También es posible introducir
un gen reportero (GFP) para identificar expresión de un plásmido, por ejemplo. Este sistema también es
usado para el sexaje de espermatozoides, diferenciando la cantidad de ADN diferencial entre el cromosoma
X y el Y; la morfología típica del espermatozoide presenta problemas, por lo cual es previamente introducido
en una cámara que alinea las células y orienta su parte plana hacia el detector.
· Adherencia: Ya lo vimos anteriormente. La capacidad de adhesión de las células es distinta según el
tipo celular y las propiedades de la superficie. Por ejemplo, se puede obtener prácticamente un cultivo
único de fibroblastos usando fibronectina y lavando. Otra proteína del suero que favorece la adhesión es la
laminina. También influye la presencia de Ca2+ (el tema de las cadherinas). Podemos modificar las
condiciones para dirigir la adhesión del tipo celular de interés.
· Immune panning: Se basa en la unión específica de anticuerpos a epítopos de la superficie
membranosa (que pueden haber sido introducidos artificialmente). Las células que los posean serán
inmovilizadas en una placa o en una columna, permitiendo lavados para eliminar las no deseadas, y
finalizando con un lavado que escinda la célula del anticuerpo.
, · MACS (magnetic soting): Similar al anterior, pero en este caso los anticuerpos se encuentran unidos a
microbolas de ferritina, pudiendo ser retenidas con un imán. No olvidemos que en todos estos casos, la
selección puede ser positiva (retener lo que nos interesa) o negativa (dejar correr lo que nos interesa), y
que la decisión debería realizarse teniendo en cuenta la eficiencia y el precio (compra de anticuerpos) del
procedimiento.
· FACS (fluorescent-activated cell sorting): Básicamente citometría de flujo usando anticuerpos a los que
se les confiere fluorescencia, detectando su intensidad. Algunos antígenos de interés son: CD3 (linfocitos T),
CD19 (linfocitos B), CD3+CD16+CD56 (natural killer), CD3+CD56 (granulocitos y monocitos), CD45 (células
hematopoyéticas), CD34 (stem cells hematopoyéticas), CD133 (stem cells generales).
CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LÍNEAS CELULARES
El objetivo es demostrar la ausencia de contaminación cruzada, confirmar la especie de origen,
establecer la correlación (linaje y grado de diferenciación) con el tejido de origen, conocer su estabilidad y
sus variaciones fenotípicas, y determinar si están transformadas. Estos requisitos de caracterización están
establecidas por las World Health Organizations (WHO). Las líneas celulares que importanmos deben
provenir de bancos acreditados que velen por el cumplimiento de los requisitos técnicos de obtención y
caracterización, autentificando y validando los datos de las lineas que se incorporan.
Los más importantes son la American Type Culture Collection (ATCC) y la European Collection of Cell
Cultures (ECACC). Las principales líneas utilizadas son humanas o de ratón, de origen tumoral, embrionario
o fibroblastos de diversos tejidos transformados e inmortalizados. Cuando lo compramos, recibiremos un
vial a -130ºC. Esta temperatura es necesaria para bloquear el metabolismo celular. No se debe almacenar
las suspensiones a -80ºC (típico de los laboratorios), porque aun ralentizado, el metabolismo continúa, y los
sistemas de comprobación de errores moleculares no van todo bien como deberían. En conclusión,
conseguiremos que nuestro cultivo pierda viabilidad y aguante un menor número de pases/generaciones.
Al realizar un depósito, el cultivo debe estar bien caracterizado. Se incluye información como la edad del
organismo de origen, enfermedades, morfología, tipo de crecimiento (suspensión o adherente),
recomendaciones de medios... etc. Además, estos bancos realizarán comprobaciones acerca de las
características descritas en los cultivos depositados, para comprobar la ausencia de contaminación y su
correcta caracterización. La caracterización incluye estudios de:
· Morfología: En algunos casos es útil para la caracterización, aunque en la mayoría de casos, una
morfología característica sólo se alcanza tras un elevado tiempo de desarrollo celular. Algunas líneas
importantes son CHO (ovario de hámster chino, muy eficientes en producción de proteínas recombinantes),
HeLa (proliferación rápida), BHK-21 (riñón de hámster bebé, para estudios de adeno y retrovirus), 3T3
(fibroblastos fetales de ratón, para feeder layers), HDF-n (fibroblastos dérmicos humanos, para toxicología).
· Cariotipado: Confirmación de la especie de origen (y algunas líneas derivadas), muy eficaz en líneas
celulares no transformadas. Las HeLa tienen 88 cromosomas. No solo es el conteo de cromosomas, sino la
distribución del material genético en los mismos.
· Análisis de isoenzimas: Angiotensina para astrocitos, creatinina quinasa en células musculares,
transaminasas en hepatocitos... También incluye proteínas específicas: GFAPs para astrocitos, desmina para
células musculares, citoqueratina para epiteliales (diferentes citoqueratinas en cada tipo de epitelio, más
diferenciación), albúmina en hepatocitos, mielina BP en oligodendrocitos, o vimentina para células
mesodérmicas (poca discriminación).
, · Detección de antígenos: Si se trata de
membrana, nos pueden servir además para selección
celular. Algunos importantes son los ya explicados en
esa misma parte: CD45 para hematopoyéticas, ojo
con que fibroblastos también salen. CD21 o CD22 o
CD19 para linfocitos B. V-CAM, L-CAM y EMA para
epiteliales. CD13 para células mieloides... →
· Marcadores de expresión: Actualmente
analizamos el linaje celular y el grado de
diferenciación mediante niveles de expresión génica
(foto de abajo). Otra opción es uso de clusters
específicos de microRNA. Esto es muy importante ya
que no siempre conseguimos acabar el experimento
y observar el desarrollo final de nuestro cultivo. Así
podemos determinar precisamente por dónde iba nuestra célula y cuál era su compromiso.
· Fingerprinting de ADN: El uso de microsatélites
(STR-fingerprinting) cuyos alelos presentan una
clara variabilidad permite permite identificar un
cultivo humano de algo no humano (8 STR), con
mucha nitidez en nuestra electroforesis. Además,
se utiliza la misma técnica para discernir entre
especies, usando el gen de citocromo-B como
discriminativo, y la proteína 16S como control
negativo del experimento. De este modo, también
se puede comprobar la existencia de
contaminación o una mala designación (decimos
que nuestro cultivo proviene de otro paciente y es
del mismo).
