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Samenvatting methoden in het biomedisch onderzoek 1

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Cours
Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1

Établissement
Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)

Een samenvatting van de hoofdstukken 8, 11, 12 en 13 (deel 1 en 2) op basis van de slides en eigen notities. Deze samenvattingen hebben mij geholpen bij het beter begrijpen van de leerstof.

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Publié le 25 avril 2021
Nombre de pages 8
Écrit en 2019/2020
Type Resume

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1.13 Analyse van DNA
1.13.1 DNA extraheren
- 1.13.1.1 Organische solventen
- 1.13.1.2 Geconcentreerd zout
- 1.13.1.3 Kolomchromatografie
- 1.13.1.4 Alkalische lyse (plasmiden)
1.13.2 DNA bewaren
1.13.3 DNA kwantificeren
- 1.13.3.1 Spectrofotometrie
- 1.13.3.2 Fluorimetrie
- 1.13.3.3 Elektroforese
1.13.4 DNA concentreren

Inleiding
DNA = drager van genetische informatie
- Voor mRNA -> eiwitten
- Voor regulatorisch RNA
- Regelelementen
= Bron van informatie ivm fysiologie en pathologie van een organisme

1.13.1 DNA extraheren
Methode =
- afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen,.....)
- afhankelijk van doel (hoeveel nodig, welke kwaliteit, …)

Elke methode: 3 essentiële stappen (komt telkens terug)
1) Lysis = cellen afbreken zodat DNA vrijkomt in de oplossing (= lysaat), lysaat = vloeistof met
inhoud van gelyseerde cellen
2) Isoleren = DNA uit het lysaat halen of opzuiveren, eiwitten en RNA afbreken
3) Oplossen = DNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij concentreren

(= meer DNA in kleiner volume)

Bloed:

1

, - Keuze anticoagulans (zie slide 1.3.37): best EDTA, heparine inhibeert DNA reacties
- Rode bloedcellen (erythrocyten): geen kern, heem uit de rode bloedcellen kan
verdere analyses met DNA inhiberen -> NH4Cl lyseert enkel cellen zonder kern zoals
rode bloedcellen
- Witte bloedcellen (leukocyten): met kern en dus DNA
- Verdergaan zoals bij cellen

Weefsel:
- Dissecteren in kleine stukjes
- Pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel
- Verdergaan zoals bij cellen

Cellen (Witte bloedcellen, PBMCs, uit weefsel, celculturen – zie 1.3) lyseren met buffer:
- SDS = Sodium Dodecyl Sulfaat: detergent voor eiwitdenaturatie en afbreken
membranen
- Enzymes die eiwitten afbreken (proteïnase K of protease)
- Enzymes die RNA afbreken (RNAse A)
- EDTA: complexeert Mg2+ -> inhibitie van Mg2+-afhankelijke enzymes zoals DNasen

1.13.1.1 Organische solventen
- Principe: organische solventen denatureren eiwitten  niet meer in waterige laag
- Historisch meest gebruikte methode (goedkoop, grote hoeveelheden), nu veel
minder gebruikt
- Nadeel:
 Restanten van organische solventen in DNA kunnen interfereren met verdere
analyses toxisch, corrosief

DNA extractie met organische solventen (fenol-chloroform)

 Aan lysaat fenol-chloroform toevoegen, goed mengen
 DNA (in waterlaag) is nu gescheiden van RNA en eiwitten

 Waterlaag (met DNA) overbrengen naar nieuwe tube
 Alcoholprecipitatie van DNA uit waterlaag (zie volgende slide)

2

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