Samenvatting van hoofdstuk6: Core DNA Technologies , Moleculaire Genetica door T. Voet en op basis van mijn notities en slides van de les. Voor de richting Biomedische Wetenschappen.
● Cel-gebaseerde klonering
○ Complex DNA-staal wordt in kleine stukjes verdeeld van werkbare grootte
vervolgens worden vectoren/genetisch gemodificeerde plasmiden en
gastheercellen worden gebruikt om DNA mengsel te fractioneren,
vermenigvuldigen en analyseren.
■ Transformatie van stukjes DNA,
via bv. elektroporatie = worden
elk afzonderlijk in cellen
(proces is dus selectief)
gebracht, vaak in snel delende cellen, bv. E. Coli
● Afzonderlijke cellen isoleren en cultiveren ⇒ DNA-opzuiveren
○ Vector
■ Bevat replicon-molecule dat er voor zorgt dat de DNA-sequentie kan
repliceren in de gastheer
■ Sommigen kunnen in een bacteriecel repliceren om hoge
kopie-aantallen te bereiken + bacterie die gekloond DNA bevat deelt
snel ⇒ groot aantal identieke bacterieklonen met elke vele vectoren
met vreemd DNA
■ Plasmiden als vector
● Niet essentiële DNA-moleculen die onafhankelijk van het
gastheerchromosoom repliceren
● Integreren niet in chromosoom gastheer = extrachromosomaal
● Meestal circulair
● Verschillenden kunnen naast elkaar bestaan
● Episomen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Bacteriofaag als vector
● Bestaan extracellulair maar hebben gastheer nodig om te
reproduceren ⇒ besmetting en lysis
● DNA/RNA genoom ingepakt in proteïne mantel
● Profagen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Genetisch gemodificatie is nodig, zodat we efficiënt een vreemd DNA
eraan kunnen verbinden en zodat getransformeerde cellen
gemakkelijker herkend worden
1
, Plaatsen van DNA stukje in vector
Gebruik van type 2 restrictie-nucleasen ⇒ knippen
DNA op plaatsen waar ze specifieke palindromen
(van 5 naar 3 leest hetzelfde als van 3 naar 5)
herkennen + zorgen voor uniforme uiteinden ⇒ kan
overhang (zie afbeelding, voordeel: ‘sticky ends’ =
door basenparing kunnen deze gemakkelijk opnieuw
verbonden worden door DNA-ligase ) of blunt zijn
● Natuurlijk doel = bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers, bv. bacteriofagen
● Plasmidevectoren bevatten klonering sites PL = opeenvolging van
restrictie-herkenningssequenties waar verschillende types nucleasen kunnen gaan
knippen ⇒ waar er geknipt is kan nu gemakkelijk een humaan stukje DNA gebracht
worden
○ Komen ook natuurlijk voor ⇒ natuurlijk doel
○ Bv. pUC19 ⇒ PL zit tussen LacI (repressor van Lacz’) en LacZ’, mechanisme om
te bepalen of er nu een humaan DNA stukje is opgenomen of niet
■ Werking:
- Bij toevoeging van IPTG aan non-recombinant DNA wordt LacI
geïnhibeerd en kan Lacz’ tot expressie komen ⇒ translatie tot
actief bèta-galactosidase ⇒ wanneer men dan X-gal toevoegt
aan de voedingsbodem, kleuren deze cellen blauw
- Recombinant DNA leidt niet tot expressie van Lacz’ ⇒ in
frame: te groot alfa-fragment waardoor inactief
bèta-galatosidase OF niet in frame waardoor ook inactief
Transformatie en fysiek scheiden van celkolonies
Op vector wordt antibioticum-resistentie gen geplaatst + transformatie in cellen die gevoelig
zijn voor antibioticum ⇒ cellen cultiveren op voedingsbodem met antibioticum waardoor
enkel de cellen met het recombinant DNA overleven. BELANGRIJK: mengsel goed
uitspreiden op petrischaal zodat kolonies, 1 kolonie groeit vanuit 1 cel elke cel heeft ander
ander DNA-fragment) goed verspreid zijn en dus makkelijk pikbaar zijn. Nu kan men uit
verschillende kolonies verschillende stukjes DNA opzuiveren.
⇒ Toepassingen
Aanmaak van genomische DNA-kloonbibliotheken
- Bevat verschillende DNA-klonen die tezamen alle verschillende DNA-sequenties in
het genoom omvatten.
2
Les avantages d'acheter des résumés chez Stuvia:
Qualité garantie par les avis des clients
Les clients de Stuvia ont évalués plus de 700 000 résumés. C'est comme ça que vous savez que vous achetez les meilleurs documents.
L’achat facile et rapide
Vous pouvez payer rapidement avec iDeal, carte de crédit ou Stuvia-crédit pour les résumés. Il n'y a pas d'adhésion nécessaire.
Focus sur l’essentiel
Vos camarades écrivent eux-mêmes les notes d’étude, c’est pourquoi les documents sont toujours fiables et à jour. Cela garantit que vous arrivez rapidement au coeur du matériel.
Foire aux questions
Qu'est-ce que j'obtiens en achetant ce document ?
Vous obtenez un PDF, disponible immédiatement après votre achat. Le document acheté est accessible à tout moment, n'importe où et indéfiniment via votre profil.
Garantie de remboursement : comment ça marche ?
Notre garantie de satisfaction garantit que vous trouverez toujours un document d'étude qui vous convient. Vous remplissez un formulaire et notre équipe du service client s'occupe du reste.
Auprès de qui est-ce que j'achète ce résumé ?
Stuvia est une place de marché. Alors, vous n'achetez donc pas ce document chez nous, mais auprès du vendeur EmilieFZ. Stuvia facilite les paiements au vendeur.
Est-ce que j'aurai un abonnement?
Non, vous n'achetez ce résumé que pour €5,00. Vous n'êtes lié à rien après votre achat.
