H1 – Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
1 Inleiding
1.1 Wat te kennen?
Overzicht verschillende methodes (doelen?/toepassingen + nieuwe ontwikkelingen
en perspectieven), per methode principe begrijpen (hoe werken ze, waarop
gebaseerd, waarop letten in de praktijk), verschillende methodes vergelijken en een
keuze maken (voor- en nadelen afwegen, ethische aspecten en kosten?,
mogelijkheden en beperkingen), resultaten interpreteren, alles combineren om een
eenvoudige concrete vraagstelling te beantwoorden.
2 Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Onderzoek kan gebeuren op een organisme, weefsel, cel of subcellulair (vaak
combinatie). Dit is op de mens of modelorganismen (cellen, fruitvlieg, muis,…).
2.1 Type onderzoeken
Open exploratief onderzoek = breed zoeken naar een antwoord zonder specifieke
richting (hoe komt het dat sommige mensen zo sterk reageren op COVID?).
Hypothese-gedreven onderzoek = onderzoek waar een antwoord/hypothese
vooropgesteld en getoetst wordt (speelt de vrijzetting van cytokines een bepalende rol
bij de reactie op een COVID infectie?). Nadeel = al wet kennis hebben, voordeel =
duidelijk dus makkelijker om geld te vragen.
Fundamenteel onderzoek = gedetailleerde analyse van de moleculaire bestanddelen
en processen in de cel en in het organisme. Nog geen toepassing op de mens (geen zicht
op therapie) Bv. EW heeft rol in een ziekte. Hoe werkt het?
,H1 – Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Translationeel onderzoek = maakt de overgang tussen fundamenteel en klinisch
onderzoek. Kunnen we met kennis fundamenteel ziekte bestrijden? Vertalen naar mens.
Klinisch onderzoek = Patiënt gericht (optimaliseren diagnose, verbeteren behandeling,
nieuw geneesmiddel,…) = metingen bij de mens (fase I, II, III, IV)
2.2 Verschillende systemen
In vivo = bepalingen bij levende organismen (lichaamstemp., bloeddruk, medische
beeldvorrming,…)
Ex vivo = metingen op stalen (vers) van een organisme (immunohistochemie van biopt)
In vitro = metingen in proefbuis (DNA conc. Bepalen, PCR,…)
In silico = analyse met computer (analyse genexpressiedata, studie
interactienetwerken,…)
2.3 Klassen van methoden
Methoden voor analyse = iets meten (hormoonlevel, metabolieten, sequentiebepaling
DNA)
Methoden voor modulatie = we veranderen iets aan organisme om na te gaan of er iets
gebeurt (behandeling met inhibitor enzymactiviteit, transfectie met plasmidevectoren,
RNA interferentie,…)
2.4 Eigenschappen van methoden
Precisie Maat voor reproduceerbaarheid (zeer gericht meten)
Acuraatheid Verschil gemeten waarde en echte waarde (liefst zo
klein mogelijk) (bv. 0,8 en 1,3 mg kan een
weegschaal weergeven als 1 wat niet zo acuraat is)
Detectielimiet/gevoeligheid Kleinste waarde die gemeten kan worden
Kwantificatielimiet Kleinste waarde die voldoende acuraat gemeten kan
worden
Analytische/dynamische Gebied waarin gemeten kan worden (wat apparaat
range kan meten
Specificiteit/selectiviteit Mate waardoor andere componenten in het systeem
interfereren (bv. interferende componenten die ook
licht absorberen)
Sensitiviteit Maat van verandering in output tov. verandering in
input
,H1 – Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Robuustheid Mate waarin methode een consistent resultaat geeft
ondanks kleine verschillen in experimentele
parameters (pH, temperatuur,…)
Dit is belangrijk in de selectie van een methode: vereiste precisie? Detectielimiet (kleine
of hoge conc. DNA?),…
2.5 Kwaliteitcontroles
Geen eten, drinken, gesloten labojas, veilig stellen resultaten, controle temperatuur,
controle toestellen, organisatie, afvalverwerking,…
Negatieve controle = bevat alles, behalve het te onderzoeken analyt. Zo kan nagegaan
worden dat een eventueel effect te maken heeft met het analyt of iets anders.
Positieve controle = geeft een positief resultaat wel de juiste verandering? Is dit te
onderscheiden van een negatief resultaat? Werkt de apparatuur goed? -) controle
systeem
Systeemvalidatie = Bevestigen dat systeem waarmee je meet goed werkt (resultaten
betrouwbaar?) en toepasbaar is op onderzoeksvraag (werkt je apparatuur, + controle).
, H2 - RNA
1 Inleiding
RNA verschilt van DNA doordat:
- het enkelstrenig is met uracil ipv thymine (stabieler);
- het korter is + kan secundaire en tertiaire structuren hebben;
- 2’ OH groep (3’OH vormt helix) bevat wat vatbaar is voor afbraak door enyzm
RNAsen (heel stabiel, geen co-factoren nodig).
Er bestaan verschillende soorten RNA waaronder mRNA (kleine hoeveelheid ivm. Andere
soorten), rRNA en tRNA.
RNA bestaat uit exonen en intronen (gaan eruit tijdens de splicing van pre-mRNA bv.
naar mRNA) en een poly-A staart aan de 3’ kant. De 5’ cap (gemodificeerde G, met
trifosfaatbrug) en de poly-A staart (50-250) staat niet gecodeerd in DNA maar worden
post-transcriptie toegevoegd.
2 Staalafname
Wanneer RNA afgenomen wordt, kunnen er problemen optreden:
- RNA profiel verandert door bijvoorbeeld inductie genen;
- RNA degradatie door endogenen (in staal) of exogene (buitenaf) RNAsen;
- DNA contaminatie doordat de scheiding meestal onvolledig is.
De staalafname in bloed gebeurd met EDTA als anticoagulans. Heparine inhibeert
DNA/RNA reacties en is dus minder geschikt. Na afname kan RNA gestabiliseerd worden
(degradatie en/of inductie voorkomen) door:
