Notes de cours
Microscopie et régulation cellulaire - Apoptose (CM 11 et 12)
A)Introduction
- Historique.
- Principaux types de mort cellulaire.
- Fragmentation de l’ADN au cours de l’apoptose.
- Détection des cellules apoptotiques.
B) Fonctions.
1) Élimination par apoptose des cellules sans fonction.
2) Élimination par apoptose des cellules en excès.
3) �...
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Notes de cours
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Apoptose.
Libération du cytochrome C concerne les mammifères, mais pas tous les organismes,
des divergences.
A) Définitions.
Historique. 1842. Observations développement embryologique : des neurones
surnuméraires perdus au cours du développement. 1965. Apoptose, nécrose et des
sous-familles d’apoptose (pyroptose par exemple qui font intervenir des caspases
différentes). 2002. Régulation génétique. Description de C. elegans > toujours le
même nombre de cellules sont perdus par apoptose > mutagenèse, des cellules en
plus survivent, donc contrôle par les gènes.
Deux principaux types de mort cellulaire.
• Apoptose. Corps apoptotiques de l’apoptose sont des vésicules que des
macrophages absorbent, le contenu cellulaire n’est jamais libéré dans milieu
extracellulaire > donc pas de réaction immunitaire. La phosphatidylsérine
est un lipide présent uniquement sur couche interne de la membrane plasmique
> première conséquence de l’induction apoptose est inversement de côté
(passage externe), par l’annexine 5. Apoptose difficile à observer, car
cellules ont tendance à se décrocher du support, très peu adhérentes (sauf en
MET et MEB).
• Nécrose. Réaction immunitaire car contenu cellulaire dans extracellulaire
(bien qu’une partie soit absorbée par phagocytose). Morphologiquement très
différent aussi (lisse puis éclatement).
Clivage internucléosomal de l’ADN dans les cellules apoptotiques (pas un
clivage enzymatique). Migration de l’ADN génomique sur un gel > normal ADN à haut
poids moléculaire. Anormal > une échelle, différentes tailles d’ADN. Ou bien voir
temps de réponse des cellules après clivage de l’ADN. Traitement avec anticorps anti-
Fas (activation apoptose) > combien de temps la cellule met à fragmenter son ADN.
Au bout de 3h on commence à voir, à 6h quasiment toutes les cellules sont
entrées en clivage. Traitement arrêté au bout d’une heure > beaucoup de cellules
peuvent encore annuler apoptose, mais à 6h impossible.
Fragmentation de l’ADN au cours de l’apoptose. Activation apoptose, les
caspases (protéases) activent l’endonucléase CAD présente sous forme inhibée
iCAD dans cellules normales > l’endonucléase activée peut cliver l’ADN.
Détection des cellules apoptotiques. Par cytométrie de flux (taille et
granulométrie), les cellules apoptotiques sont petites et granuleuses. Avec des
agents fixant l’ADN (Hoechst 33342, gros blancs = très marqués), plus de
compaction d’ADN durant apoptose. Analyse par FACS après marquage TUNEL,
avec nexine 5, toujours par détection de fluorescence, toutes les cellules sont
comptées. Pic à 10 ou 10 2 = bruit de fond, car tous les débris sont compté
(expérimentateur décide ce qui est bruit de fond). On peut mettre un filtre sur taille
des cellules mesurées > les trop petites sont alors considérées comme débris
cellulaires et corps apoptotiques.
