1. Inleiding
1.1. Belang van methoden
1.2. Doestelling van de cursus
1.3. Inpassing in de leerlijnen Ba BMW
1.4. Organisatie van de cursus
1.5. Inhoud
1.6. Examens
2. Biomedische vraagstelling en Onderzoeksmethodiek
2.0. open exploratief hypothese-gedreven
2.1. fundamenteel/translationeel/klinisch
2.2. analyse in vivo, ex vivo, in vitro, in silica
2.3. vereisten/eigenschappen v methoden
2.4. ontwerp v biomedische experiment
2.5. selectie methoden
2.6. methoden voor analyse en voor modulatie
2.7. statische bepalingen vs kwantitatieve , dynamische en vergelijkende analyse
2.8. experimentel variatie
3. Sudiemateriaal
3.0. humaan organisme
organisme zelf, fysiologische vloeistoffen of weefselbiopten geeft goed de werkelijkheid
weer.
Informed consent is een belangrijk gegeven! Patiënt moet voldoende ingelicht zijn en moet
uit project kunnen stappen op elk moment.
3.1. modelsystemen
3.1.1.Xenograft je kan humaan weefsel in een muis aanbrengen die immuundeficiënt is( zo
geen afstoting). Vb. nu/nu, SCID, RAG… tekorten in immuuncellen.
3.1.2.Weefsel (explant)- cultuur (humaan en andere) thema 5
3.1.3.modelorganismen
- muis representeert het best de mens, maar verschillend immuunsysteem…
- gist meest eenvoudige eukaryote cel.
- worm vooral gekend voor studies met neuronen
- fruitvlieg belangrijk geweest in ontdekking en studie van chromosomen
- kikker( leavis en tropicalis) embryologische studies
- zebravis angiogenesestudies
3.2. Staalbereiding
3.2.1. Staalname vloeistoffen nemen of weefselbiopten (dissectie=traag of naald=snel)
3.2.2. (micro)dissectie en fractionatie snel invriezen, RNAlater (blokkeert proteïnen).
3.2.3. cell sorting (FACS: fluorescence activated cell sorting)
3.2.4. bewaring en biobanking
- bewaring: invriezen of RNAlater
- fixeren klassieke voorbeel is formaldehyde.
- Weefselcoupes: vriescoupes, paraffinecoupes
- Microtomen: schijfjes weefsel aanmaken.
3.3.5.weefselhomogenisatie en cellyse verschillende mogelijkheden: beads, enzymatische
lyse, vriezen en ontdooien, sonicatie… keuze afhankelijk van wat je wil onderzoeken.
1
LD
,4. Basistechnieken
4.0. Pipetteren; vloeistof opzuigen (nauwkeurig V) en overbrengen naar ander recipiënt
Volumetrische: nauwkeuriger, maar 1 volume opnemen
Gegradueerde: verschillende V
Pasteur: geen spec volume, gwn overbrengen
Micro: zeer precies volume (piston en luchtkamer)
1 vd belangrijkste bronnen v fouten en cross-contaminatie
- Systematische fouten (beperkte precisie vh instrument): afh v volume, calibratie
- Systematische en random fouten te wijten aan omgeving: temp en
luchtvochtigheid
- Systematische en random fouten te wijten aan de onderzoeker: foute instelling,
onnauwkeurigheid, onoplettendheid
- Tips voor gebruik (nrml een air pipet gebruiken): capillariteit (kwaliteit tips),
viscositeit/volatiliteit (pos displacement pipet (PDP) = tip is ook de piston), forward
vs reverse pipet), cross-contaminatie (filtertips of PDP, duur!)
4.1. Centrifugatie; scheiding cellen, organellen en biomoleculen = gebaseerd op sedimentatie
(G = ω2.r en RCF (g) = G/9.81 m/s2 en RCF (G) = 11,7 x r x (rpm/1000)2)
Begrippen (dia 7)
- Sedimentatiesnelheid
- Sedimentatiecoëfficient (S = v/G) in Svedberg
- Elke rotor heeft een k-factor (k = t/S)
4.1.1. Klassieke centrifugatie; pelletteren in standaard buffer op een bep snelheid
4.1.2. Differentiële centrifugatie; weefsel homogeniseren, kernen en cellulair debris,
mitochondria, iedere x aan hogere snelheid centrifugeren, steeds kleinere delen vd cel
afzonderen
4.1.3. Densiteit centrifugatie;
Zonale centrifugatie = ‘snelheids sedimentatie’, afh van grootte en migratie over een
stijgende densiteitsgradiënt, hoe kleiner partikel hoe lager, korte centrifugatietijd en
kleine snelheid
Isopycnische centrifugatie = ‘evenwichts sedimentatie’, hoe denser meer beneden,
lange centrifugatietijd, grote snelheid
Bepaalde gradiëntvormers; verschillende voor- en nadelen aan densiteitsvormers
- Suikers zoals sucrose (stapgradiënt of continu, nadeel ivm osmolariteit van je cel)
- Polysacchariden zoals Ficoll (enkel voordelen)
- Percoll (geen permeabiliteit, lichtabsorbantie vanaf 280 nm (ew ook))
- Gejodeerde materialen (ideel voor scheiding v cellen en organellen)
- Cs-zouten (lage viscositeit, hoge osmolariteit)
4.1.4. Types centrifuges
- Lage snelheidscentrifuges; 4000-13000 rpm, afdraaien cellen, sommige
precipitaten, condensvocht
- Hoge snelheidscentrifuges; 25000 rpm, bact, celkernen, precipitaten, sommige
virussen, vele rotortypes en volumes
2
LD
, - Ultracentrifuges; 40000-80000 rpm, preparatieve (vacuum om opwarming te
voorkomen, dikke stalen kuip, subcellulaire deeltjes of virussen scheiden) en
analytische (fysische eign v zuivere macromoleculen te bestuderen)
4.1.5. Types van rotoren
- Vaste hoek rotoren; schuine gaten, kleine k (snellere sedimentatie), pelletteren
(bereiding v plasmiden DNA), diff centrifugatie (celfragmenten, organellen)
- Swinging bucket rotoren; onder rotor hangen buisjes, zwieren horizontaal,
gradcentrifugatie v DNA/RNA, grotere capaciteit en gemak scheiding v fases,
langere scheidingstijd
- Vertikale rotoren; RCFmin is groot door max straal rotor, deeltjes leggen korte
afstand af, kleine k-waarde (goed voor isopycnisch)
- Zonale rotoren; rotor zelf gevuld met grad en te scheiden staal, grotere V, rotor
met septa om convectie te verminderen, continue doorstroming, grote capaciteit
4.1.6. Toepassingen
- Pelletteren v cellen en bact
- Afdraaien condensvocht
- Bereiding plasmide
- Precipiteren DNA/RNA, eiwitten
- Celfractionatie
- Filteren v opln
- Studie v aggregaten v biomoleculen
4.2. Spectrometrie; gebaseerd op interactie tussen elektromagnetische straling en materie
(langere golflengte (rechts in spectrum) is kleinere freq)
4.2.1.Interactie met materie; absorptie en emissie, 280 voor EW, 260 voor DNA, absorbantie(A)
, wet van Beer-Lambert,
4.2.2. Spectrofotometer;
- Lichtbron = wolfraamlamp (ZB en IR) of H 2 of D2 lamp (UV)
- Golflengte selector = absorptiefilter (glas met metaaloxides) of interferentiefilter of
dichroïsche spiegel (spacer bepaalt welke golflengtes erdoor gaan) of
monochromator (prisma of rooster, grating, beste!)
- Cuvetten = borosilicaatglas (>350nm), kwarts voor UV (<350nm), kunststof als met
micro-organismen werken bv (>350nm)
- Detectie = fotobuis (licht omzetten naar stroom om het te meten, lichtstraal op
metalen plaatje (cathode), elektron w losgeschoten en w aangetrokken tot een pos
stukje metaal (anode), op beide een spanning zetten en je kan de stroom meten,
niet gevoelig genoeg!) OF fotomultiplier (fotonen op eerste metalen plaatje,
elektronen los, op dynode (iets pos plaatje), zo meerdere elektronen losmaken,
veel groter signaal en zelfs klein verschil in signaal toch k meten)
- Meting = staal, solvent, standaard cstaal/cstandaard = (Astaal - Asolvent) / Astandaard-Asolvent)
- Toepassingen = concentratiebepaling (DNA, RNA, EW), detectie, identificatie v bep
functionele groepen in een molecule
3
LD
, 4.2.3. Spectrofluorimeter; sommige moleculen zenden ook licht uit owv fluorescentie (emissie-
licht) aan langere golflengte dan invallend licht (excitatie-licht)
- Lichtbron = Xe lamp of Hg lamp/laser (xenon en kwik)
- 2 monochromatoren = excitatie en emissie, gemeten onder hoek v 90°,
fotmultiplier (detector)
- Voordelen tov absorptie = gevoeliger, nauwkeuriger, specifieker, selectiever (2 λ)
- Toepassingen: conc meting v fluo stoffen, fluo tags, FRAP, FRET, FACS (verder HF5)
4.3. Radiometrie (radio-isotoop technieken); dus hier niet kennen!
4.3.1. Autoradiografie
4.3.2. Scintillation proximity assay (SPA)
4.4. Chromatografie; fysische methode om componenten te scheiden tussen 2 fasen, een
stationaire fase en een mobiele fase
4.4.1. Scheiding obv verschillende principes; iets absorberen op het opp van de kolom, anion-
kation binding (ion exchange), size exclusion (grote k er niet door), affinity (ab en antigen
bindt), partition chromatography
4.4.2. Liquid chromatografie; mobiele fase is een vloeistof, stationaire fase is vlak (papier, dunne
laag silica gel) of kolom
4.4.3. Gas chromatografie; mobiele fase is een gas
4.4.4. Toepassingen; scheiden v ew, lipiden, steroïden, kleine DNA fragmenten, metabolieten,…
4.5. Elektroforese: scheiding v geladen deeltjes in gel oiv elektrisch veld
4.5.1. Principe; elektrisch veld doet geladen deeltjes bewegen, gel werkt als zeef, scheiding
volgens lading en grootte, DNA is neg geladen, migreert naar pos pool, ew geven we
artificieel een lading door te laten binden aan SDS (detergent) en ew ontrollen door
denaturatie, groottes vgln, dichter netwerk = grote biomoleculen blijven vanboven hangen
4.5.2. Agarose gel; scheiding v nucleïnezuren DNA/RNA, dye is ethidium bromide of Sybr Safe
(onder UV licht zb)
4.5.3. Polyacrylamide gel; scheiden v kleine DNA fragmenten en ew, SDS moet dus toegevoegd
worden voor de ew, gescheiden obv grootte
4.5.4. Bio-analyzer; veel verschillende stalen allemaal tegelijk onderzoeken met verschillende
elektroforese technieken, sneller en op grote schaal analyseren, alles minimaliseren, wat
analyseren? RNA, DNA, ew, zuiverheid, hoeveelheid ew bepalen, grootte, dus via een heel
kleine hoeveelheid staal veel info bekomen en in een korte tijd
4
LD
,5. Celcultuur en celbiologische methoden
Focus op biologisch functioneren van cellen, cellen zijn niet statisch maar vertonen allerlei
functies of processen: celproliferatie, celdood, senescentie, celmigratie, invasiviteit, adhesie,
belangrijk in fysiologie en pathologie
5.0. Types van cel en weefselculturen
5.0.1.Cellen komen uit patiënt of proefdier, weefsel/orgaan/biopt uit nemen en als
orgaancultuur heel kort bewaren, als je langer testen wilt doen dan primaire celculturen
maken, hoe cellen uit het weefsel halen? 2 technieken;
- Explant cultuur = weefsel in stukken snijden en de cellen gaan spontaan migreren in
omgeving waarop ze kunnen aanhechten
- Dissociatie cultuur = weefsel volledig openbreken, kleine fragmenten uitplaten en
cellen gaan ook aanhechten
- Cellen opgroeien = eindige cellijnen, cel uit orgaan kan enkele dagen zich aanhechten
en overleven, maar het proces is niet oneindig, op bep moment gn cellen massaal
dood, in aantal cellen kan spontaan of door toepassen ve techniek mutaties ontstaan,
celcyclus controle wordt voor een deel opgegeven, worden continue cellijnen
- Wat doen met eindige cellijnen? Terug naar 3D omgeving brengen, recombineren,
organotypische culturen (weer cel-cel interacties maken waardoor info bekomen kan
worden over gedrag v cellen in weefselomgeving (tissue engineering))
5.1.2. Weefsel (orgaan)-culturen;
- Voordelen = makkelijk manipuleerbaar, behoud cel-cel interacties
- Nadelen = beperkt houdbaar, dedifferentiatie
5.1.3. primaire culturen; rechtstreeks bereid van weefsel (heterogene mix van versch
celtypes) via = mechanische dissociatie (scalpels (weefsel in kleine brokjes maken), tritureren
(via serologische pipet of micropipet, opzuigen vd cellen en terugblazen, als passeren door
opening: getrek aan de weefsels), zeven) en enzymatische dissociatie om celmatrix te breken
(trypsine, hyaluronidase, dispase, collagenase)
- enzymatische digestie = voordelen (cel-cel interacties, ene celtype GF voor andere
afscheiden), nadelen (instabiel, samenstelling verandert)
5.1.4. eindige cellijnen; na subcultivatie v primaire celcultuur (Hayflick limiet v 60tal x delen)
- Voordelen = mog voor vele celtypes, zuiver of co-culturen, eig bewaren maar ook
dedifferentiatie, mak manipuleerbaar
- Nadelen = enkele passages (verkorten v telomeren), moeilijk om zuivere culturen op
te zetten
5.1.5. geïmmortaliseerde cellijnen;
- Werkwijze = primaire culturen opzetten, transfecteren met SV40 large T antigen
(bindt RB en p53) en/of met TERT (= telomerase reverse transcriptase) of infecteren
met EBV, culturen doorkweken en stocks invriezen
5.1.6. kankercellijnen; afgeleid ve tumor, HeLa cells
-Voordelen = doorkweken, mak beschikbaar, mak manipuleerbaar, relatief goedkoop,
opnieuw kweken als xenograft in vivo
- Nadelen = afwijkend, eign veranderen, heterogeen karyotype
- Toepassing = hybridoma technologie, grote hoeveelheden antibodies maken
5
LD
, 5.1.7 Algemene voor- en nadelen van celculturen; dia 13!!!
- Voordelen = in gecontroleerde omgeving kweken, miniaturisatie, goedkoper dan
dierproeven, ethiek (MEGG)
- Nadelen = serum nodig, steriliteit, besmettingen, instabiliteit, andere celinteracties,
Emetabolisme, cellijnmisidentificatie (~cellijn authentificatie) (BIASEC)
5.2. Stamcellen
5.2.1. In alle multicellulaire organismen, zelfhernieuwing, differentiëren in verschillende
gespecialiseerde celtypes
- Totipotent = volledig organisme
- Pluripotent = alle 3 de kiembladen
- Multipotent = alle celtypes binnen 1 kiemlaag
- Oligopotent = enkel celtypes binnen 1 kiemlaag
- Unipotent = 1 celtype
5.2.2. Adulte stamcellen; herstelsysteem voor het lichaam (beenmerg, bloed, vetweefsel) =
multipotent
5.2.3. Embryonale stamcellen; isoleren als blastocyst (ICM eruit halen) is pluripotent
- Nadelen = ethische controverse, pre-differentiatie noodzakelijk (teratomas
vormen), immuunrespons
5.2.4. Geïnduceerde pluripotente stamcellen; dedifferentiatie opleggen aan adulte cellen via
set van 4 factoren (Klf4, Oct4, Sox2 en cMyc) of Sendai virus gebruiken om cellen te
reprogrammeren
- Voordelen = pat spec, lang geëxpandeerd worden, alle celtypes in vitro aanmaken
- Nadelen = karyotype checken, diff tot bep celtype nog niet goed gecontroleerd,
variabiliteit, weinig robuust diff protocols, duur
5.3. Subcultivatie en cryopreservatie
5.3.1. Subcultivatie; doubling time, passage, split ratio, confluentie, medium vervangen na 2 a
3 dagen, cellen oogsten = enzymatisch (trypsine, collagenase, dispase) of trituratie
(verkleinen v celaggregaten door op en neer te pipetteren)
- Tellen = celsuspensie + trypaanblauw, dringt dode cellen binnen, maar levende niet
via Burker telkamer (vermenigvuldigen met 10^4)
- Geautomatiseerd tellen = tellen v cellen en grootte meten (celsuspensie mengen
met trypaanblauw, in wegwerptelkamer pipetteren, in toestel brengen), snel en
precies, maar duur
- Coulter counting = tellen v cellen en grootte meten, cellen in een vloeistofstroom
door kleine porie, elektrische geleding verandert, afh vd grootte, we meten dit,
werkwijze (cellen mengen met elektroliet, opzuigen in CC, verandering in stroom
meten)
5.3.2. Cryopreservatie; bewaren v cellen = DMSO (vriespuntverlaging, betere dehydratering)
en FBS medium, rate-controlled cooling in isopropanol, -1 graad/min, -80 en dan transfer
naar vlbare stikstof
- Ontdooien = moet snel, DMSO is toxisch, dilutie in groeimedium, centrifugatie,
resuspensie en uitzaaien
6
LD
, 5.4. Media en materialen
5.4.1. Statisch en dynamisch
5.4.2. Celcultuur media; basale media, fetaal kalf serum (nadelen = batch variatie, groei
inhibitiefactoren, niet gedefinieerd, mogelijke contaminatie, ethische bezwaren), alternatieve
Ebronnen, pH buffer en pH indicator (fenolrood, paars of geel w), antibiotica, medium
sterilisatie (filtratie, bewaren op 4 graden in het donker)
5.5. Celcultuuromgeving
5.5.1. Toestellen; CO2 incubator (37°C), bioveiligheidscabinet (laminaire flow) = luchtstromen
w gecreëerd, ofwel omgeving beschermen of stalen of beide, Klasse I, II en III en
bioveiligheidsrisicoklassen (4)
5.5.2. Sterilisatie en desinfectie; (1) doden v alle (micro)organismen via vochtige hitte
(autoclaaf), droge hitte, gas, straling of filtratie of (2) verhinderen vn overdracht v microO via
vernevelen v 70% ethanol of isopropanol, straling (UV vorming v thymine dimeren)
5.5.3. Contaminatie; door operator, omgeving, incubator,… van bacterieel, gist, schimmel,
virus
- Detectie = macroscopisch (verkleuring media, troebel w), microscopisch,
mycoplasma (PCR test, colorimetrische test)
5.6. Cellen scheiden, flow cytometrie
5.6.1. FACS = fluorescence activated cell sorting; spec celtype isoleren uit een heterogeen
mengsel cellen
- Principe = cellen v interesse merken met fluo ab, door small buisje, in druppeltjes
uit buisje laten komen, laser activeert fluo groep, licht detecteren en juiste druppel
een lading geven, via elektroden w de geladen deeltjes gescheiden en gecollecteerd
in aparte buisjes
5.6.2. MACS = magnetic activated cell sorting; cellen v interesse merken met magnetisch
gelabelde ab, celsuspensie op kolom in sterk magnetisch veld, gelabelde blijven in kolom
(handig voor grote hoeveelheden)
5.6.3. Merkeranalyse (niet scheiden, maar kijken); tellen welk % vd cellen een bep merker
bevat, met flowcytometer, versch ab gebruiken is mogelijk, emissie w per cel bepaald, voor
enkele duizenden cellen
5.6.4. Viabiliteit: apoptose/necrosetest; in suspensie onderscheiden en telllen
- Principe = propidium iodide kan alleen necrotische cellen binnendringen,
intercaleren met DNA en fluo w, Hoechst 33342 dringt zowel levende als dode cellen
binnen, gecondenseerd chromatine (apoptotische cellen) kleuren, via flow cytometry
detecteren
5.6.5. Celyclusanalyse; cellen in versch fasen vd celcyclus onderscheiden en tellen
- Principe = S fase (DNA aanmaken en zijn aneuploid = chromosomen missen of
teveel bevatten), G2/M fase (dubbel zoveel DNA als in G0/G1 dus dubbel zoveel
propidium iodide opnemen)
- Werkwijze = cellen permeabiliseren met 70% ethanol en kleuren met PI, flow
cytometry
7
LD
, 5.7. Viabiliteitstesten
5.7.1. MTT test; levende cellen tellen
- Principe = gele MTT (tetrazolium) omgezet w naar paars formazan door
mitochondriaal reductase, kleuring evenredig met aantal cellen
- Werkwijze = cellen opgroeien in 96-well plaat, MTT toevoegen, incuberen,
detergent toevoegen en OD meten (optical density), absorbantie bij 690 nm
5.7.2. BrdU test; celproliferatie meten (bromodeoxyuridine)
- Principe = BrdU thymidine analoog, w tijdens S fase v celcyclus ingebouwd
- Werkwijze = 96-well plaat, BrdU toevoegen, incuberen, cellen permeabiliseren en
gemerkt antiBrdU toevoegen, merker meten
5.7.3. Tunel test; meten v apoptose
- Principe = apoptotische cellen kleuren door DNA fragmentatie te detecteren via
inbouw vn dUTP door TdT
- Werkwijze = weefselcoupe maken en fixeren of cellen op draagglaasje fixeren en
permeabiliseren, TdT toevoegen samen met BrdU, ingebouwd BrdU detecteren met
gemerkt ab
5.7.4. Viabiliteitstest met live/dead kleuring; onderscheiden/tellen v levende en dode cellen
in suspensie, adherente of weefselcultuur
- Principe = calcein AM door celmembraan migreren, gehydrolyzeerd door
intracellulaire esterases tot calceine (groen fluoresceren), kan nt meer door intacte
celmembraan en ethidium homodimeer-1 bindt DNA en fluo rood, kan alleen door
beschadigde membranen v dode cellen
- Werkwijze = kleurstoffen op cellen of weefsels brengen, incuberen, fluo w
microscopisch bekeken, dode rood, levende groen
5.7.5. Senescentietest; senescente cellen identificeren en tellen
- Principe = zo’n cellen brengen Beta-galactosidase tot expressie, cellen kleuren
hiervoor door X-Gal toe te voegen blauw product
- Werkwijze = cellen of weefselcoupes inhiberen met X-Gal
5.8. Celadhesietesten
5.8.1. Celadhesietest; adhesie v cellen aan matrixew meten
- Principe en werkwijze = cellen uitzaaien op cultuurplaatje gecoat met matrixew, na
1 uur losse cellen wegwassen en de vasthangende kleuren en tellen
5.8.2. Wound healing migratietest; migratie v cellen meten
- Principe en werkwijze = in confluente celcultuur kras maken met pipetpuntje,
omliggende cellen zullen migreren (snel of traag)
5.8.3. Boyden chamber migratietest; migratie v cellen meten
- Principe = cellen door poriën ve membraan oiv attractans en aan andere kant v
membraan meten
- Werkwijze = cultuurplaatje met cultuurmedium met attractans, insert in hangen
met poreus membraan, cellen uitplaten in serumvrij medium, incuberen, cellen aan
bovenkant membraan weghalen met wattenstaafje, cellen aan onderkant kleuren en
tellen
8
LD
, 5.8.4. Boyden chamber invasietest; invasiviteit v cellen meten
- Principe en werkwijze = nu een extracellulaire matrix (basement membraan), cellen
moeten zich hierdoor een weg banen
5.9. Cel monitoring
5.9.1. Impedantiemeting; proliferatie of adhesie v cellen meten ‘in real time’
- Principe en werkwijze = cellen uitplaten op gouden elektrodes, cellen hechten of
prolifereren groter opp bedekken, verschil in stroom daardoor die doorheen de
elektrodes vloeit, evenredig met de totale opp vd celcultuur (meer weerstand)
5.9.1. High definition imaging; proliferatie of migratie v cellen meten ‘in real time’
- Principe en werkwijze = een microscoopsysteem ingebouwd in de CO2 incubator
5.10. 3D-cultuur en tissue engineering
5.10.1. Cellen samenbrengen in een 3D construct dat weefselstructuur nabootst, dus
combinatie v cellen, matrix en groeifactoren
5.10.2. Organoïden (gebruikmaken v spontane ontw v stamcellen tot meer gediff structuren,
cellen aansturen om richting een bep celtype te gaan, dit gebeurt via het medium, goed
doen: sturen naar de ontw ve bep weefseltype), bio-printing (cellen en biomateriaal
combineren, zo een bep structuur creëeren), bio-artificiële spieren (spiervezels, klein beetje
contraheren, er ontbreken wel nog dingen, handig voor spierziektes), organs-on-chips (voor
screening, kleine stukken weefsel gebruiken, op zo weinig mogelijk cellen metingen
uitvoeren)
9
LD
