Cytologie Practicum II haalt aan wat de doelstellingen zijn van Genexpressie en Gentransfer. Daarnaast wordt er ook gesproken over Basale kloneringsplasmiden en Expressieplasmiden en hoe deze opgebouwd zijn. Hierna wordt overgegaan op het Tet - on en Tet - off systeem. De T's (Transductie, Transfec...
Antwoord: 1) Doelstelling 1: Expressie van eiwitten voor de productie van eukaryotische eiwitten
2) Doelstelling 2: Bestuderen van het ingebrachte gen
Doelstelling 3: Optimalisering van bepaalde cellen
2.
Geef een omschrijving van een Defect gen
Antwoord: Een gen dat niet meer werkt bijvoorbeeld als gevolg van een mutatie
3.
Omschrijving Transfectie
Antwoord: Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen via niet-virale methodes. Bvb. Elektroporatie, Ca3(PO4)2
4.
Omschrijving Transductie
Antwoord: Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen door gebruik van virussen Bvb. Retrovirale of adenovirale vectoren
5.
Omschrijving Transformatie
Antwoord: et DNA wordt binnengebracht in gistcellen of bacteriën Het binnenbrengen van DNA in plantencellen is ook transformatie Bvb. Via hitteshock of Elektroporatie
De term Transformatie wordt ook gebruikt in de oncologie . Als er gesproken wordt over getransformeerde cellen (of cellijnen) betekent dit dat normale cellen gewijzigd (getransformeerd) zijn en dat een tumorcel kan ontstaan. Dit kan het gevolg zijn van een virale infectie of blootstelling aan carcinogene stoffen
6.
Omschrijving Basale kloneringsplasmide
Antwoord: Basale kloneringsplasmiden bevat noodzakelijke onderdelen voor de constructie van een plasmide in prokaryote cellen
7.
Onderdelen Basale kloneringsplasmide
Antwoord: Multicloningsite Knipplaats voor restrictie-enzymen --> Gen inbrengen
Ori van replicatie
Start van replicatie in prokaryote cel
Selectie gen vb. antibioticum resistentie gen
8.
Hoe gebeurt de Selectie van een insert in een Basale kloneringsplasmide
Antwoord: 1) Aanwezigheid van 2 antibioticum resistentiegenen
2) Selectie door aanwezigheid alfa - fragment (LacZ)
9.
Omschrijf selectie door 2 antibioticumresistentiegen genen
Antwoord: Zonder insert:
Een bacteriecel met resistentiegenen tetracycline en ampicilline kan groeien in aanwezigheid van tetracycline en ampicilline
Insert in tetracycline resistentiegen
Een bacterie die een insert opgenomen heeft in het tetracycline resistentiegen kan niet meer groeien in aanwezigheid van tetracycline, wel nog in aanwezigheid van ampicilline
10.
Omschrijf selectie door alfa - segment
Antwoord: Als substraat kan X-gal of ONPG gebruikt worden.
De bacterie bevat het LacZ-gen, maar het bezit een M15 - deletie. Dit zorgt ervoor dat een inactief Beta - galactosidase aangemaakt gemaakt wordt. Dit wordt het omega - fragment genoemd.
Het plasmide bevat het LacZ alfa - fragment.
Als de bacterie het plasmide opgenomen heeft, kan het omega - fragment binden met het alfa - fragment. Deze binding zorgt voor een functioneel Beta - galactosidase dat het X - gal kan omzetten tot een blauwe kleur
Voorbeeld van de inhoud
CYTOLOGIE PRACTICUM II
INHOUDSOPGAVE
Gentransfer en Genexpressie ............................................................................................................................ 3
Doelstelling van gentransfer en genexpressie in hogere eukaryotische cellen ................................................ 3
Transfectie, Transductie, Transformatie ........................................................................................................ 3
Basale kloneringsplasmiden en expressieplasmiden ...................................................................................... 4
Basale kloneringsplasmiden....................................................................................................................... 4
Selectie voor de insert ............................................................................................................................... 4
1) Aanwezigheid van 2 antibioticumresistentiegenen ....................................................................... 4
2) Selectie door gebruik te maken van lacZ en alfa – complementatie............................................... 6
Expressieplasmiden ................................................................................................................................... 7
Fusie-eiwit ......................................................................................................................................... 7
Promotor........................................................................................................................................... 8
Tet-on en Tet-off als induceerbare promotors .................................................................................... 9
Transiënte en stabiele transfectie................................................................................................................ 10
Transiënte transfectie ............................................................................................................................. 10
Stabiele transfectie ................................................................................................................................. 11
Specifieke selectie van stabiele transfectanten ........................................................................................ 12
1) Drug – resistentiegen ................................................................................................................. 12
2) Salvage pathway ........................................................................................................................ 12
Transfectietechnieken................................................................................................................................. 13
Keuze van transfectiemethode ................................................................................................................ 19
Detectie van geproduceerde eiwit ............................................................................................................... 19
Rapporteergenstudies ................................................................................................................................. 20
Doelstelling van rapporteergenstudies .................................................................................................... 20
Normalisatie............................................................................................................................................ 21
Mogelijke rapporteergenen ..................................................................................................................... 22
Fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie .................................................................................................. 24
Fluorescentie .............................................................................................................................................. 24
Andere types........................................................................................................................................... 24
Aankleuren van eiwitten met fluorescentie ............................................................................................. 25
Kleuren van cellulaire structuren of processen ..................................................................................... 25
Fluorescentiemicroscoop ............................................................................................................................ 26
Flowcytometrie en celsorting ...................................................................................................................... 27
In vitro celkweek : Tellen en Splitsen ............................................................................................................... 28
1
, Cellen tellen ................................................................................................................................................ 28
Voorbereiding op het tellen..................................................................................................................... 28
Opties om een celcultuur te tellen ....................................................................................................... 28
Gebruik van een Bürker telraam .............................................................................................................. 28
Cellen splitsen ............................................................................................................................................. 29
Oefening (Gelijkaardig op het examen)........................................................................................................ 30
Cytologie Deel Praktijk .................................................................................................................................... 31
Stable and transient transfection of plasmid DNA in eukaryotic cells ........................................................... 31
Preparation of the plasmid DNA .................................................................................................................. 31
WORKFLOW ............................................................................................................................................ 31
Analyse van de DNA concentratie en puurheid ........................................................................................ 32
Subcultivation of Eukartoyic cells ................................................................................................................ 33
Transient transfection Using Calcium phosphate transfection method ......................................................... 33
Principe Calcium phosphate transfection method .................................................................................... 33
Transient transfection using LipofectAMINE ................................................................................................ 34
Principe LipofectAMINE ........................................................................................................................... 34
Transient transfection by Elektrporation ..................................................................................................... 34
Principe Elektrporation ............................................................................................................................ 34
Detection of β – galactosidase by 2 methods ............................................................................................... 35
Histochemische methode → X – gal......................................................................................................... 35
Colorimetrie methode ............................................................................................................................. 35
Detection of GFP by fluorescence microscopy ............................................................................................. 36
Begrippenlijst Cytologie Practicum II ............................................................................................................... 37
2
,GENTRANSFER EN GENEXPRESSIE
DOELSTELLING VAN GENTRANSFER EN GENEXPRESSIE IN HOGERE EUKARYOTISCHE CELLEN
➔ Doelstelling 1: Expressie van eiwitten voor de productie van eukaryotische eiwitten
o Dit eiwit kan dienen als medicijn of als vaccin
o Complexere eiwitten kunnen niet aangemaakt worden in een eenvoudige bacterie cel
▪ Deze dienen aangemaakt te worden in eukaryotische cellen omdat ze zorgen voor
een juiste post – translationele modificatie zoals:
• S -S binding
• Fosforylatie
• Glycolysatie
➔ Doelstelling 2: Bestuderen van het ingebrachte gen (of een gedeelte ervan, vb. de promotor)
o Hierbij kan een gen knock-out of knockdown transfectie uitgevoerd worden
o Zo kan de lokalisatie van een onbekend eiwit bepaald worden
▪ Komt het voor in de kern?
▪ Wat is de functie?
▪ Beïnvloedt het andere eiwitten (Signalisatie)
➔ Doelstelling 3: Optimalisering van bepaalde cellen
o Cellen krijgen een “nieuw gen”
▪ Dit kan een extra gen zijn dat niet aanwezig is in dat type cellen of een gen dat een
defectief gen vervangt
▪ Defectief gen = een gen dat niet meer werkt bijvoorbeeld als gevolg van een mutatie
o Wordt vaak toegepast in in vivo gentherapie
TRANSFECTIE, TRANSDUCTIE, TRANSFORMATIE
Transfectie Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen via niet-virale methodes.
Bvb. Elektroporatie, Ca3(PO4)2
Transductie Het DNA wordt binnengebracht in eukaryotische cellen door gebruik van virussen
Bvb. Retrovirale of adenovirale vectoren
Transformatie Het DNA wordt binnengebracht in gistcellen of bacteriën
Het binnenbrengen van DNA in plantencellen is ook transformatie
Bvb. Via hitteshock of Elektroporatie
➔ De term Transformatie wordt ook gebruikt in de oncologie
o Als er gesproken wordt over getransformeerde cellen (of cellijnen) betekent dit dat normale
cellen gewijzigd (getransformeerd) zijn en dat een tumorcel kan ontstaan
▪ Dit kan het gevolg zijn van een virale infectie of blootstelling aan carcinogene stoffen
3
, BASALE KLONERINGSPLASMIDEN EN EXPRESSIEPLASMIDEN
BASALE KLONERINGSPLASMIDEN
➔ Basale kloneringsplasmiden bevat noodzakelijke onderdelen voor de constructie van een plasmide in
prokaryote cellen
➔ Onderdelen voor de constructie van een plasmide
o Multicloningsite
▪ Knipplaats voor restrictie-enzymen
• Gen inbrengen
o Ori van replicatie
▪ Start van replicatie in prokaryote cel
o Selectie gen vb. antibioticum resistentie gen
➔ Bij aanmaak van cDNA – banken kunnen basale kloneringsplasmiden gebruikt worden
SELECTIE VOOR DE INSERT
1) AANWEZIGHEID VAN 2 ANTIBIOTICUMRESISTENTIEGENEN
➔ Bij het kloneren van het insert in 1 van de 2 restrictiegenen, gaat de resistentie verloren
De bacterie kan groeien in aanwezigheid van De bacterie kan groeien in aanwezigheid van
ampicilline of tetracycline (Tet). Bezit nog ampicilline maar niet meer in aanwezigheid
beide restrictiegenen van tetracycline. Door een insertie van DNA
gaat de resistentie verloren
4
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper matissem. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,99. Je zit daarna nergens aan vast.
