Samenvatting
Samenvatting Moleculaire Genetica Diagnostiek
Samenvatting + notities van tijdens de les
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 37 pagina's
Voorbeeld 4 van de 37 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
1 Analysemethoden voor nucleïnezuren1.1 Inleiding
- Menselijk Genoomproject: 1990 – 2003 (> 10 jaar om genoom te sequensen)
- Vorderingen erfelijkheidsonderzoek:
▪ Eenvoudige stamboomanalyses → minuscule structuurveranderingen in chromosomen zicht-
baar maken
▪ Voor veel ziekten: verantwoordelijke gen en welke fout in gen
- Nieuwe behandelingen:
▪ Productie recombinante eiwitten (= eiwit dat men aangemaakt heeft door de code van het EW
in te brengen in m.o. of zoogdiercellen) voor therapie
▪ Gen- en stamceltherapie
- Diagnosetechnieken:
▪ Cytogenetische onderzoeksmethoden → uitzicht chomosomen
▪ Moleculaire onderzoeksmethoden → structuur aparte DNA-moleculen
1.1.1 Cytogenetische onderzoeksmethoden
1.1.1.1 Karyotypering
- Vertrek uit perifere bloedmonocyten (PBMC)
- Ook soms uit beenmerg, gekweekte huidfibroblasten, cellen van vruchtwater of chorion (één van
de membranen tussen foetus en moeder) villi
- Toevoegen fytohemagglutinine → stimulatie T-lymfocyten → mitose
- Na 48 – 72 uur: toevoeging colchicine (interfereert met de vorming van spoeldraden)→ stopt
celdeling in de metafase (chromos. net zichtbaar)
- Toevoegen hypotone oplossing → water opnemen → opzwellen → individuele chromos. scheiden
- Fixeren
- Op microscoopglaasje + drogen
1.1.1.2 G-banding
Gebruik van Giemsa-kleuring → G-banding: alternerende lichte en donkere bandjes, karakteristiek
voor ieder chromosomenpaar:
- Donkere bandjes: weinig genen, zijn
AT-rijk en repliceren laat in S-fase
- Lichte bandjes: 80% actieve genen
(huishoud-genen), GC-rijk en repliceren
vroeg in S-fase
- Precieze identificatie elk chromosoom
en ontbreken of bijkomen DNA-
materiaal tot 4000 kb
- Betere resolutie = FISH (fluorescence in situ hybridization), FCM of analyse DNA met aCGH (array
comparative genomic hybridision)
Alternatief: Quinacrine-kleuring → Q-banding
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 1
,1.1.1.3 Flow karyotypering
- Modernere techniek met betere resolutie
- Gebruikt om variatie in chromos. na te gaan en identificatie chromosoomafwijkingen
- Resolutie = 1 – 2 Mb t.o.v. 4 Mb voor lichtmicroscopische karyotypering
Resultaat:
- Flow karyotypes man en vrouw, elke piek =
individueel chromosomenpaar van groepen
chromosomen
- DNA-inhoud individuele chromosomen meten
m.b.v. FCM → vloeistofstroom door laser
- Chromosoomsuspensie kleuren: ethidium
bromide = fluorescerende kleurstof
- Meting: fotomultiplier
- Analyse: m.b.v. computer
- Resultaat:
▪ Histogram/ flow karyotype → chromos.
groeperen volgens stijgende DNA-inhoud
▪ Relatieve DNA-inhoud = gem. piek
▪ Relatief # chromos. in elke groep =
oppervlak onder piek (normaal 2)
▪ X-chromos. bij vrouw 2x groter dan bij man
1.1.2 Moleculaire onderzoeksmethoden
= bestuderen nucleïnezuren
Hoe?
- DNA- en RNA-isolatie
- DNA-detectie:
▪ Elektroforese
▪ Hybridisatie
• DNA probes
• Detectie van labels
• Stappen in het hybridisatieproces
• Hybridisatiemethoden
- DNA profielen
- Array-based Comparative Genome Hybridisation (aCGH)
- PCR en afgeleide technieken
- DNA sequentiebepaling: de ultieme diagnostische tool → 3FBT
1.2 DNA- en RNA-isolatie
- mRNA’s isoleren: poly(A)-staart aan 3’ eind
- Isolatie via poly(T)oligonucleotide te koppelen op magnetische beads
- Rnase vrij werken (bakken glasmateriaal, handschoenen dragen) en gebruik Rnase-remmers
- DNA: denaturatie en extractie
- Detectie:
▪ UV-absorptie DNA en RNA bij 260 nm
▪ UV-absorptie eiwitten bij 280 nm
▪ OD-ratio? 260 nm/ 280 nm → zuiverheid staal (DNA isoleren uit bloedstaal met EW)
▪ Intercalerende kleurstoffen (nestelen zich tussen baseparen): fluorescerende DNA en RNA
kleurstoffen → EtBr of SYBR Green
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 2
,1.2.1 DNA isolatie
- Via denaturatie en extractie
- Gebruik van zouten om eiwitten te denatureren en hoogmoleculaire NZ in oplossing
te houden
- Isoleren: absorptie op silicadeeltjes (kolommen) of filtratie over semi-permeabele
membraan waaraan DNA blijft plakken = DNA-vlok
1.2.2 mRNA isolatie
→ magnetische bolletjes met een T-staart
→ mRNA kan binden door hun A-staart
1.3 DNA-detectie
1.3.1 Gel-elektroforese
- Gebruik van agarose matrices (of polyacrylamide)
- DNA- en RNA moleculen d.m.v. hoog oplossend
vermogen scheiden
- Door negatief geladen fosfaatgroepen → nucleïne-
zuren bewegen zich bij pH 7 à 8 naar + pool
- Migratiesnelheid is afhankelijk van: type gelmatrix,
poriëngrootte, moleculaire afmetingen NZ en
conformatie NZ
Procedure:
Houder afplakken → “kammetje” plaatsen met slotjes → DNA staal laden → agarose in buffer brengen
→ opwarmen in microgolfoven → afkoelen tot 55°C → uitgieten → agarose gaat stollen = geleren →
einde elektroforese → op UV-transeleminator bekijken (tegenwoordig in geïntegreerd systeem)
1.3.1.1 Intercalerende stoffen
Ethidiumbromide
- Licht op bij UV licht
- Uiterst mutageen → vermijden → nu gebruik SYBR Safe!
- Werking: kruipt tussen baseparen → gebruik UV licht → DNA moleculen zichtbaar
SYBR Green = SYBR Safe
- Excitatie: max = 497 nm
- Emissie: max = 520 nm → licht uitzenden
- Minder mutageen dan EtBr, maar cytotoxisch → penetreert cellen
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 3
, 1.3.1.2 DNA gelelektoforese
Negatieve pool
Groot
Klein
Positieve pool
Legende:
- Links = lengtemerken van DNA-fragmenten met gekende grootte
- Midden = DNA geknipt mey drie verschillende restrictie enzymen
- Rechts = controle DNA, niet geknipt
1.3.1.3 RNA gelelektroforese
Negatieve pool
Positieve pool
Moeilijker, uit één celtype al het mRNA of totaal RNA isoleren → alle fragmenten verschillende lengte
→ nooit genoeg RNA-moleculen van zelfde lengte om zichtbaar te zijn op gel (bepaalde detectielimiet)
Wat is wel te zien:
- 28S rRNA (intenisteit 2x zo groot als de intensiteit van 18S rRNA)
- 18S rRNA
Legende:
- Laan 1 en 2: intacte RNA-stalen met 28S:18S rRNA ratio = 2:1
- Laan 3: gedegradeerd RNA met RNA smeer onder 28S en 18S rRNA bandjes
- Laan 4: gedegradeerd RNA → verlies 28S rRNA band en opstapeling gedegradeerd RNA onderaan
- Laan 5: RNA met aanzienlijke genomische DNA contaminatie
1.3.1.4 Polyacrylamide gelelektroforese
- Voor scheiden van DNA
- resolutie of oplossend vermogen → mogelijkheid om zeer kleine verschillen in lengte van elkaar
te onderscheiden (1 tot enkele nucleotiden)
- Handig voor zeer korte fragmenten
MV Moleculaire Genetica: ‘diagnostiek’ 4
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper amberdams. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €14,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 56326 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen