METHODEN
H1: INHOUD
Inleiding: belang van methoden, doelstelling van de cursus, inpassing in de leerlijnen, organisatie,
inhoud, examens
Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
Studiemateriaal en staalbereiding: humaan organisme, modelsystemen (weefsel, xenograften,
weefselcultuur, celculturen,, modelorganismen), staalbereiding (staalname, (micro)-dissectie en
fractionatie, cel sortering, bewaring en biobanking)
Basisprincipes van bio-veiligheid: wanneer en waarom dragen we een labo-jas, veiligheidsbril,
handschoenen,…? Klassen van bio-veiligheid; basis van afvalproblematiek.
Meten en schatten: eenheden en omzetten van eenheden; nauwkeurigheid en meetfouten;
systematische fouten; random fouten; absolute en relatieve fouten; beduidende cijfers; schatten van
grootteorders. Basis van excel (gemiddelde, mediaan,…)
Elementaire basistechnieken: pipeteren; verdunningen, buffers en fysiologische oplossingen; meten
van de osmolariteit; pH-bepaling; sedimentatie en centrifuge
Licht- en fluorescentiemicroscoop: fysica van licht en golven, basisprincipes van optica, principe van
de lichtmicroscoop en fluorescentemicroscoop.
Luminescentie, fluorescentie: principe, toepassingen in biomedisch onderzoek
Spectroscopie: infraroodspectroscopie, NMR-spectroscopie, massaspectrometrie, UV-zichtbaar licht-
spectroscopie
Chromatografie: gaschromatografie, vloeistofchromatografie, HPCL,…
Elektroforese, western blot: principe, toepassingen in biomedisch onderzoek
Celbiologische methoden: celproliferatie, celdood, migratie, invasiteit, tissue engineering,…
Analyse van DNA: isoleren, in vitro aanmaken van DNA, concentreren, kwantificeren, manipuleren,
DNA-sequentiebepaling
H2: BIOMEDISCHE VRAAGSTELLING EN ONDERZOEKSMETHODIEK
HET DOMEIN VAN HET BIOMEDISCH ONDERZOEK IS ZEER BREED
Disciplines
Fysiologie: hoe werkt ons lichaam?
neurowetenschappen, cardiologie, hematologie, endocrinologie,…
Pathologie: wat loopt er fout?
neurodegeneratieve aandoeningen, hart- en vaatziekten, kanker, diabetes, infectieziekten,…
ER IS EEN ZEER BREED GAMMA AAN VRAAGSTELLINGEN
Open exploratief hypothese-gedreven
Open exploratief onderzoek:
= onderzoek waarbij we breed gaan zoeken naar een antwoord zonder een specifieke richting te
kiezen. Vb. Hoe beïnvloeden androgenen het ontstaan en de progressie van prostaatkanker?
onderzoeken welke genen/eiwitten worden geregeld door androgenen in prostaatkankercellen
Hypothese-gedreven onderzoek:
= onderzoek waarbij we een antwoord vooropstellen (hypothese) en dit toetsen
Vb. Wordt prostaatkanker beïnvloed door androgenen via modulatie van het Ets gen?
1
, de hypothese is dat Ets hierin een rol speelt deze hypothese kan experimenteel getest worden
Fundamenteel / translationeel / klinisch
Fundamenteel
= gericht op een gedetailleerde analyse van de moleculaire bestanddelen en processen in de cel en in
het organisme
Translationeel
= maakt de overgang tussen fundamenteel en klinisch onderzoek
Klinisch
= patiëntgericht
optimaliseren van diagnose
verbetering van behandeling
nieuw geneesmiddel
PICO principe van ‘evidence-based medicine’
(Patient – Intervention – Controls – Outcome)
Fasen 1 – 4
Analyses in vivo / ex vivo / in vitro / in silico
In vivo: bepalingen bij levende organismen (bv. lichaamstemperatuur, bloeddruk,… meten)
Ex vivo: metingen op stalen van een organisme (bv. immuunhistochemie van biopt,…)
In vitro: metingen in de proefbuis (bv. bepaling van DNA concentratie, PCR reactie,…)
In silico: analyses met een computer (bv. (re)analyse genexpressiedata,…)
ONTWERP VAN BIOMEDISCHE EXPERIMENTEN
Probleem
Literatuurstudie
onderzoeksvraag /hypothese
biologisch systeem / modelsysteem
bepaling van de variabele (wat meten?)
keuze van methode (hoe?)
uitvoering experiment
herhaling experiment
analyse van de experimenten + statististische testen
formulering van conclusie
2
,TWEE GROTE KLASSEN VAN METHODEN
Methoden voor analyse Methoden voor modulatie
We meten iets We veranderen iets aan het organisme/proefmodel
Voorbeelden: Voorbeelden:
- Klinische analyse (hormonen, metabolieten,…) - Behandeling met inhibitor
- Isolatie, meting, sequentiebepaling van DNA,… - Transfectie met plasmidencectoren
- Analyse van processen (gentranscriptie) - Transgenese
- RNA interferentie
STATISCHE BEPALINGEN VERSUS KWANTITATIEVE, DYNAMISCHE EN VERGELIJKENDE ANALYSE
Statische bepalingen Kwantitatieve, dynamische & vergelijkende analyse
We bepalen iets dat relatief onveranderlijk is of dat We bepalen iets dat makkelijk varieert en een range
discrete waarden (identificatie) geeft van waarden kan hebben
Voorbeelden: Voorbeelden:
- Bepaling van gensequentie - Meting van cholesterolspiegels
- Bepaling van intron-exon boundaries - Meting van suikerspiegels voor en na maaltijd
- Identificatie van interagerende eiwitten - vgl transcriptoom van gezond versus ziek weefsel
VEREISTEN / EIGENSCHAPPEN VAN METHODEN
Precisie = variabiliteit: maat voor reproduceerbaarheid standaard deviatie, coëfficiënt van variatie
Accuraatheid: verschil tussen gemeten waarde en de “echte” waarde populatiestatistiek
(confidentieniveau / confidentie-interval)
Detectielimiet = gevoeligheid: kleinste waarde die met een bepaalde gekozen zekerheid kan gemeten
worden
Analytische range / dynamic range: gebied dat reproduceerbare gegevens geeft
Analytische specificiteit = selectiviteit: mate waardoor andere componenten in het systeem
interfereren
Analytische sensitiviteit: maat van verandering in output tov. de verandering in input
Robuustheid: mate waarin de methode een consistent resultaat geeft ondanks kleine verschillen in
experimentele parameters (bv. pH)
SELECTIE VAN METHODE
Criteria:
Te meten variabele (bv DNA concentratie, DNA sequentie, eiwitfosforylatie,…)
Vereiste precisie, detectielimiet (bv hoge versus lage DNA concentraties)
Aantal stalen / waarden (bv DNA sequentie van 1 PCR product of van het hele genoom)
Beschikbaarheid apparatuur (bv heb ik een fluorimeter voor DNA bepaling of een colorimeter)
Kosten (wat kan ik besteden per assay?)
Veiligheidsrisico’s (mag ik werken met radioactiviteit, virussen?)
Vroegere / gepubliceerde ervaringen
Persoonlijke voorkeur
3
, H3: STUDIEMATERIAAL
HUMAAN ORGANISME
Studies op organisme zelf
Vb. klinische test, beeldvorming
Fysiologische vloeistoffen (liquid biopsies):
Urine, speeksel, bloed (inclusief cellen), cerebrospinaal vocht (ruggenmergpunctie)
Weefselbiotopen
Chirurgisch weefsel, naaldbiopten
Voordelen: meest direct relevant voor geneeskunde
Mogelijkheden: vgl. gezond versus ziek, voor en na behandeling, individuen onderling, meting van
parameters in functie van leeftijd of uur van de dag,…
Nadelen: beperkte mogelijkheden voor testing en modulatie
Types studies
Interventionele / niet-interventionele studie
Patiënten / vrijwilligers
Prospectieve / retrospectieve studie
Cross-sectionele / longitudinale studie
Aandachtspunten bij studie-ontwerp
Algemeen principe: maximale voordelen, minimale risico’s
Gezondheid en veiligheid van deelnemers
Databeheer
– EU General Data Protection Regulation (GDPR)
– Persoonlijke Informatie (persoonlijke, medische, genetische, …)
– Versleuteling stalen en gegevens
– Bewaring, toegang, beveiliging, delen
Geïnformeerde toestemming en ethische goedkeuring
Ethische goedkeuring bij onderzoek met mensen of menselijk materiaal
Vrijwillige en geïnformeerde toestemming
– Vrijwillige deelname, deelname kunnen weigeren of stopzetten zonder consequenties
– Begrijpbaar informatieformulier
– Informeren over doel, methode, procedure, voordelen, risico’s, recht op stopzetting
deelname
– Schriftelijke, ondertekende informed consent
– Speciale voorzorgen bij kinderen of kwetsbare groepen
Goedkeuring Clinical Trial Center en Ethische Commissie UZ Leuven/KU Leuven
– http://www.uzleuven.be/ec/
– Maakt deel uit van arts-patiënt relatie
– Hoofdonderzoeker Good Clinical Practice certificaat
Declaration of Helsinki
EU en nationale wetgeving
4
