1) Problemen
→ Staalname => verandering RNA profiel
→ RNA degradatie > endogeen/ exogeen (RNAse)
→ DNA contaminatie
2) Staalname
→ Anticoagulans = EDTA (niet heparine > inhibitie)
→ RNA stabilisatie
− Invriezen in N
− Bewaarmiddel = PAXgene (bloed), RNAlater (cel), Trizol (weefsel)
3) Staalverwerking/ bewaring
→ RNAse vrij => DEPC (carcinogeen), andere inhibitoren
→ Nuclease vrije oplossingen
→ 1 jaar op -80°C
→ Langer: alcoholprecipitaat
4) DNA contaminatie
→ Enkel probleem als onderscheid nodig is
→ Detectie = RT – controle/ elektroforese
→ Verwijderen: DNAse behandeling => verlies RNA mogelijk
RNA EXTRAHEREN
→ Afh v startmateriaal en doel
1) Lysis => °lysaat
→ Remmers ongewenste moleculen
→ Detergenten
→ Vriezen en ontdooien => cryopreservatie nodig
→ Mechanisch: pestel/ beads
→ Vloeibaar: glazen pestels, mild, organellen intact
→ Sonicatie: DNA/RNA mee fragmenteren
2) Isoleren => RNA uit lysaat halen
→ Organische solventen = trizol
− Zuur => breekt DNA af
− Guanidium thiocyanaat => lysis + inhibitie RNAse
− Goede opbrengst + zuiverheid
→ Alcoholprecipitatie => RNA uit waterlaag
− Zout (Na-acetaat) + alcohol (ethanol/isopropanol) => neerslaan RNA
− Terug oplossen in water/ buffer
− Lage conc => lage T/ glycogeen toevoegen
→ Kolomchromatografie => RNA uit waterlaag
− Silica kolom: selectieve binding RNA > buffer
− Elutie > water/ buffer
− Goede zuiverheid <-> beperkte opbrengst
− Chaotrope zouten in buffer => nuclease inhibitie
, 3) Oplossen => gewenste hoeveelheid
→ Alcoholprecipitatie/ kolom => ook opzuiveren
→ Concentrators
− Centrifugatie door filter volgens grootte
− Geen zout toevoeging
− Max capaciteit: te veel => verstopping
→ Speedvac
− Verdamping solvent
− Zouten/ onzuiverheden niet weg
RNA KWANTIFICEREN
→ Inschatting opbrengst
→ Te laag => onvoldoende input
→ Te hoog => inhibitie/ saturatie
Spectrofotometrie Absorptie licht door RNA (260nm)
Aspecifiek, overschatting, geen onderscheid DNA/RNA
Wet Lambert-Beer => hoeveelheid RNA
Miniatuur = nanodrop
RNA > DNA absorberen
A260/280 < 2 => eiwitcontaminatie
A260/230 < 2 => zoutcontaminatie
Fluorimetrie Binding moleculen (ribogreen)
Selectief voor RNA, nauwkeurig, gevoelig
Omslachtig, licht/T-gevoelig
Lage concentraties
Elektroforese Scheiding RNA obv grootte
Concentratie, intactheid, lengte
(semi)kwantitatief
Agarose
→ Kan denaturerend
→ Totaal EU RNA = 28S en 18S bandje
→ gDNA contaminatie => hoog bandje
→ geen mRNA detecteren
Capillair
→ fluo kleurstof gebruiken
→ concentratie bepaling
→ RIN = 10 => volledig intact
→ RIN > 7 => NGS mogelijk
,RNA IN VITRO AANMAKEN
→ Bestuderen: RNA structuur/ eiwit-interacties
1) Chemisch = keten NTers maken => korte RNAs
2) Enymatisch = TXN
→ Polymerasen
− 5->3 elongatie
− Coderende streng = sense = positief
− Template streng = anti sense = negatief
− Uit bacteriofagen
→ DNA template
− Plasmide, PCR fragment, cDNA
− Terminatie = signaal/ einde fragment
− Initiatie: promotor/ in plasmide/ adaptor toegevoegd
RNA REVERSE TRANSCRIPTIE
→ In vivo: rerto virussen, telomerasen
In vitro: RNA -> cDNA => verder onderzoek
→ Buffer: DTT, RNAse inhibitor & ionen
geen herhaling van stappen!
Korte primer => lage T
1) Reverse transcriptase (uit virussen)
→ 5->3 DNA polymerase
→ RNAseH activiteit
− RNA-cDNA hybriden afbreken
− Bij aanmaak 2e streng nodig
− Beperkt lengte van cDNA
− RNAseH- voor lang cDNA
→ Te hoge T => denaturatie sec structuur, GC rijke template nodig
→ Geen amplificatie fouten
→ TdT activiteit => 3’ NT toevoegen (voor RNA seq)
2) Primers
→ Oligo dT
− Complement aan poly A staart
− Volledige lengte cDNA
− Enkel mRNA
− 3’bias > bij lang RNA/ sec structuur stopt TXN => minder 5’ eindes TXN
→ Random hexameren
− Efficiënt, voor al het RNA
− Gelijke vertegenwoordiging alle fragmenten
− Geen volledige lengte cDNA
, → Gen specifiek
− Moeilijk toepasbaar voor genen tegelijk
− Moeilijk voor weinig abundante genen
− Combinatie met qPCR
→ Bijzondere toepassingen
− Combinatie primers
− miRNA TXN
3) cDNA kloneren
→ expressievectoren maken
→ cDNA bib maken
→ dubbelstrengs cDNA nodig: RT (+PCR)
Blunt end
Niet directioneel oligo dT primer
Directioneel extra sequentie toevoegen
-> restrictie site
-> homologe recombinatie site
-> promotor voor TXN
Blauw = adaptor
Groen = primer
Ligatie onafhankelijk geen RE en ligatie
Niet directioneel TdT => C aan 3’ toevoegen
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper JenteDG. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €5,99. Je zit daarna nergens aan vast.
