Samenvatting theorie toolbox - biotechnologie

Toolbox biotechnologie: Hoofdstuk 3
PCR = polymerase chain reaction / polymerase ketting
reactie
 Er is voldoende DNA nodig om een duidelijk bandenpatroon te kunnen herkennen
 Belangrijke tool om 1 stukje DNA/RNA in vitro miljoenen keer te vermenigvuldigen in korte tijd (± 2u)
 lijkt erg op DNA replicatie in natuur
 amplificatie = kleine hoeveelheden DNA vermenigvuldigen
 kan zeer specifiek een bepaalde regio van de DNA sequentie detecteren

Toepassingen PCR
 Diagnose ziekte en opsoren van genen
 Identificatie bacteriën en virussen als er niet genoeg startmateriaal is om het direct op gel te zetten
om aan te tonen wat de ziekteverwekker is
 Covid-19 word gediagnosticeerd via een PCR test
 Er word een DNA-extratie gedaan van een neus-keelswap met viraal materiaal waar men
vervolgens een PCR reactie op gaat uitvoeren die zeer specifiek is voor Covid-19
 Forensisch onderzoek
 Vaak zeer weinig DNA materiaal best eerst vermenigvuldigen vooraleer men een deftig
onderzoek kan voeren
 Authenticiteit levensmiddelen
 GMO’s van bv plantencellen om na te gaan of het organismen (plant) wel degelijk een GMO
plant is of natuurlijke plant

PCR werking en benodigdheden
 DNA template = waaruit het te onderzoeken stukje DNA (Target DNA) komt
 Primers = enkelstrengig / single-stranded (ssDNA) dat template DNA gaat afbakenen tot target DNA
 DNA polymerase = enzym dat ervoor zorgt dat de enkele streng word aangevuld tot een dubbele
streng = verlengen van keten. Kan dit alleen doen als er bouwstenen aanwezig zijn
 Bouwstenen = dNTP’s of nucleotiden
 Buffer = omdat de DNA polymerase zich in een bepaald medium moet bevinden
 Thermocycler = toestel met een thermoblok waarin men snel temperatuurschommelingen kan
teweegbrengen. In deze thermoblok kan men de typische kleine PCR epjes steken (0,5ml)

De 3 stappen van PCR
 Denaturatie = dsDNA wordt ssDNA
 Annealing = vasthechten van primers (hybridisatie)
 Extension / elongatie = verlenging van de keten

Denaturatie bij 95°C
 Het splitsen van dsDNA naar ssDNA zodat primers kunnen hechten in volgende stap
 waterstofbruggen tussen beide ketens worden verbroken maar covalente bindingen blijven
onaangetast

Annealing / vasthechten primers / hybridisatie bij 50 – 65°C
 Vasthechten van primer aan ssDNA
 Temperatuur hangt af van welke primer gebruikt word (hoe nucleotidesequentie is opgebouwd)
 2 verschillende primers in verschillende richtingen = forward en reverse primer
 DNA polymerase heeft startpunt nodig in de vorm van een stukje dsDNA = primers
 Primers = kleine stukjes ssDNA, ± 15 tot 40 bp lang, die precies complementair zijn aan de
uiteinden van het stuk DNA waarin we geïnteresseerd zijn
 primerdesign = het opleggen van specificaties aan de primers