EXAMENVRAGEN GEVORDERDE MOLECULAIRE CELBIOLOGIE
Nucleus-genoom 3D organisatie
Vraag 1: Bespreek hogere orde 3D genoom organisatieniveaus
Nucleus (kom spaghetti) dat op eerste zicht heel
random lijkt, maar in werkelijkheid zit er veel
structuur in (chromatine regulatie processen). Er zijn
verschillende niveaus van organisatie (DNA,
nucleosomen zijn geen hogere orde denk ik!!):
DNA
DNA is een dubbele helix. DNA maakt de transfer van
erfelijke eigenschappen mogelijk. DNA bestaat uit 4
basen; purinen (adenine en guanine) en pyrimidinen
(cytosine en thymine). Een DNA molecule bestaat uit
twee polynucleotideketens die bij elkaar gehouden
worden door waterstofbruggen tussen de intern
gerichte baseparen en dit volgens een strikte purine-
pyrimidine koppeling: A met T en G met C. De twee ketens zijn dus complementair en gewonden tot een
rechtshandige (rechts omhoog) dubbele helix die een diameter heeft van 2 nm. De afstand tussen de
nucleotiden is 0,34 nm en er zitten 10 nucleotiden per winding; de lengte van de winding is dus 3,4 nm. De
twee ketens lopen antiparallel, wat wil zeggen dat de ene streng van 5’ naar 3 loopt en de andere in de
omgekeerde richting en per winding is er een grote gleuf en een kleine gleuf. Het genoom is de hele
weerslag van het DNA.
Nucleosomen
Efficiënte opvouwing is een must. Dit gebeurt door binding met kleine, basische proteïnen die het DNA
omzetten naar chromatine vezels, met name de histonen. Histonen bekleden de volledige DNA streng en
balanceren door hun positieve lading het negatief geladen DNA. Er zijn 5 types histonen: H1, H2A, H2B, H3
en H4, die in bijna alle celkernen aanwezig zijn. Vier van deze histonen vormen in combinatie met DNA
regelmatige complexen, die onder de elektronenmicroscoop als parels aan een draad (beads-on-a-string)
zichtbaar zijn. Dit zijn de nucleosomen. Ieder nucleosoom bevat 8 histonen, die een kern vormen waarrond
146 bp DNA gewikkeld liggen. De nucleosoomkernen liggen dicht achter elkaar gepakt, zodat ze een
nucleoproteïnefilament van 10 nm vormen, verbonden door strengen linker- of verbindings-DNA van
telkens 50 bp. Dit 10 nm filament is verder opgespiraliseerd in helixvorm en wordt opgebonden gehouden
door de histonen van het type H1, die op de linker-regio binden en zo de ruggengraat vormen van de
elementaire chromatinevezel. Deze vezels vormen de structurele eenheid van het chromatinenetwerk en
van de chromosomen.
Lusdomeinen
Het volgende niveau van chromatine compactie behelst de opvouwing van de 30 nm vezels in lusdomeinen
van 50 0000 tot 100 000 bp. De lussen worden in stand gehouden door geregelde hechting van DNA aan
een onoplosbaar netwerk van niet-histon proteïnen. Afhankelijk van de transcriptiestatus van het
chromatine kan er nog verdere hogere-orde opvouwing plaatsgrijpen. Transcriptioneel inactief DNA is sterk
opgevouwen in heterochromatine, terwijl actief DNA vrij los opgestapeld is in euchromatine.
Door de lusdomeinen kunnen gebieden die ver van elkaar liggen in het lineaire chromosoom samen worden
gebracht in de 3D ruimte tot topologische geconcentreerde domeinen (transcription factories). Bij dit
1
,proces spelen cohesines, transcriptiefactoren en ncRNA’s (soort matrijs om complexen bij elkaar te
brengen, eigen transcription factory heeft eigen ncRNA → die complexen daar samenbrengt) een
belangrijke rol. Looping events kunnen genexpressie onderdrukken en activeren. 1 cluster van lussen =
topological activated domein. Ook lus-lus contacten worden gemaakt. Actieve genoomdomeinen worden
vaak verzameld via lussen in transcriptiedomeinen.
Chromosomale transcriptiedomeinen: TADs
TAD staat voor topologically associating domain. TADs hebben een
hogere verhouding van chromosomale contacten binnen het domein dan
erbuiten, ze worden gevormd door architecturale eiwitten en bevatten veel chromatine-lussen. TADs
correleren met regulatie van genexpressie. Er zijn specifieke domeinen met actieve transcriptie en andere
met onderdrukte transcriptie afhankelijk van groeifases, celtypes, … TADs zijn cruciaal in de
ontwikkelingsbiologie en staan onder controle van insulator eiwitten.
LAD staat voor lamina associated domain. LADs zijn vooral de genarme regio’s en ze bevinden zich aan de
periferie. Lamines regelen heterochromatine lusopvouwing. Lamine is een bescherming voor het inactief
DNA.
EXTRA INFO:
- Constitutief: is ‘altijd’ in heterochromatine status
- Facultatief: kan in heterochromatine of euchromatine status bevinden
A/B compartimenten
A: open: expressie-actieve chromatine (genrijk met hoog CG gehalte, vaak centraal)
B: gesloten: expressie-inactief chromatine (genarm, compact en aan de nucleaire periferie met veel LADs)
Chromosoomgebieden
Positionering van individuele chromosomen binnen de kern. Grote genarme chromosomen aan periferie en
kleinere genrijke chromosomen centraal. De verschillende chromosoomgebieden zijn variabel tussen
verschillende celtypes. Homologe chromosomen zijn tijdens de interfase vaak ver uit elkaar gelegen.
Vraag 2: Bespreek de rol van de nucleaire organisatie in 3D genoomorganisatie
Het eukaryote genoom is 1000 keer groter dan het genoom van bacteriën. De eukaryote genomen bevatten
veel regulatorisch DNA/RNA. De eukaryote genomen coderen voor mutlicellulaire ontwikkeling. Het
genetische materiaal is enorm toegenomen, omdat we meer flexibiliteit enz. moeten kunnen inbouwen.
Maar dit maakt ons voor een stuk ook kwetsbaar; DNA is onderhevig aan corrosie. We moeten dit DNA dus
gaan beschermen door de nucleaire architectuur (soort van beschermingsschild).
De nucleus ziet er op het eerste zich heel random uit van organisatie, maar in werkelijkheid zit er enorm
veel structuur in. Er moeten zo’n 25.000 genen gereguleerd worden, dus het zou makkelijk zijn voor de
transcriptie dat er compartimenten aanwezig zijn. Er is dus een nucleaire compartimentalisatie. Genen die
gecoreguleerd zijn, worden gebundeld in transcriptie factories (er zijn verschillende densiteiten in de kern).
Er is een tijdsgebonden verandering in de organisatie van de nucleus: bij differentiatie (bv. van stamcel)
gaat er nucleaire reorganisatie gebeuren in functie van de tijd.
Vraag 3: Hoe kan mechanische stress zorgen voor 3D genoomreorganisatie
Het is algemeen bekend dat cellen chemische signalen van hun lokale micro-omgeving waarnemen en deze
naar de kern omzetten om genexpressieprogramma's te reguleren. Hoewel een aantal experimenten
hebben aangetoond dat mechanische signalen ook genexpressie kunnen moduleren, zijn de onderliggende
mechanismen verre van duidelijk.
2
,De modulariteit in chromosoomorganisatie en
genexpressie hangt af van de nucleaire
mechanische toestand. We veronderstellen
dat mechanosensing van de extracellulaire
signalen uit de micro-omgeving resulteert in
zowel activering van specifieke
transcriptiefactoren als modulatie van de
cytoskelet-nucleusverbindingen, wat leidt tot
de rangschikking van bepaalde chromosoom-
en genbuurten. De specifieke ruimtelijke
configuraties van chromatine en post-
translationele modificaties zijn belangrijk voor
het begeleiden van transcriptiefactoren naar
hun doelgenen en het verkrijgen van optimale
transcriptionele outputs om cellulaire
homeostase te behouden. We suggereren dat
het verlies van dergelijke ruimtelijke
chromatineconfiguraties kan leiden tot
transdifferentiatie en het ontstaan van
verschillende ziekten.
Figuur 2: Schematisch overzicht van nucleaire
envelopeiwitten die betrokken zijn bij
krachtoverdracht naar de kern. a,
Krachtoverdracht naar de kern omvat Figuur 1. Nucleaire mechanotransductie
interactie van cytoskeletelementen
(actinefilamenten, intermediaire filamenten,
microtubuli) met nesprin-eiwitten op de ONM (= outer
nuclear membrane) die kracht overbrengen via SUN
(Sad1 Unc-84)-domeineiwitten op de INM (= inner
nuclear membrane) naar de nucleaire lamina en het
interieur. b, Organisatie van het cytoskeletnetwerk in
spiercellen, inclusief de sterk geordende actine-
myosinestructuren die contractiele sarcomeren en
myofibrillen vormen. Kernen bevinden zich aan de
periferie van de cel, waar ze interageren met de
spierspecifieke eiwitten dystrofine (via
actinefilamenten) en desmine. Aanvullende eiwitten,
zoals LINC-complexeiwitten en lamines, kunnen
betrokken zijn bij het verankeren van de myonuclei en
bij het genereren en overbrengen van krachten tussen
de kern en het cytoskelet.
Onder invloed van stress kunnen bepaalde speckles
ontstaan: invloed op nucleaire fluïditeit.
Structurele eiwitten (filamenteuze eiwitten) die
nucleair cytoskelet vormen (van belang bij
mechanosensing): gekoppeld aan lamine (nucleaire
membraan). Belangrijk om nucleus te vervormen en Figuur 2. Schematisch overzicht van nucleaire envelopeiwitten die
betrokken zijn bij krachtoverdracht naar de kern.
fluïditeit vervormen (cel in andere omstandigheden).
3
, Naast het organisatie van het genoom zorgen de nucleaire lamines ook voor belangrijke contacten met het
cytoskelet. De nucleoskelet eiwitten reageren op mechanosensing (fysieke vervorming van nucleus).
Zowel de genexpressie als de LAD en TAD organisatie wordt beïnvloed door mechanische stress.
Mechanische stress zoals het platduwen van de cel wordt waargenomen in de filamenteuze eiwitten. Deze
zijn gekoppeld aan lamines. En de lamines spelen een grote rol bij de organisatie van het genoom,
specifieker bij de TADs en LADs.
Door een andere organisatie van het genoom krijgen we ook een ander regulatie patroon.
Implicaties: bij microscopie te hard op dekglaasje duwen → mechanische stress op cellen → processen in
celkern verstoren → creëren van artefacten onder invloed van mechanosensing.
Vraag 4: Verklaar ziektebeeld Progeria
Mutaties in lamines (vooral A/C type) en in lamine
geassocieerde proteïnes leiden tot een variëteit
aan degeneratieve ziektes (laminopathieën), zoals
het verouderingssyndroom Progeria.
Nucleaire lamines zijn betrokken bij chromosoom-
en chromatineorganisatie. De patiënten hebben
een defect in de splicing, zodat ze een toxisch
lamine product aanmaken en zo kan de nucleaire
lamine structuur niet meer normaal georganiseerd
worden. Dit toxisch lamine product begint te
accumuleren (zelfde fenoom als bij gezonde
mensen die ouder worden). Dus: progeria
patiënten hebben een mutatie waardoor splicing
niet goed meer werkt. Er is een splice boundary
mutatie → verkeerde splicing → toxisch lamine
product → nucleaire lamine structuur niet meer
normaal georganiseerd → ontregeling van genoom opvouwing en genregulatie. Zo is het genoom niet meer
juist georganiseerd. De toxische dosis wordt na 10 jaar al bereikt en zo ontstaan ouderdomssymptomen,
die ook aanwezig zijn bij gezonden mensen vanaf 70 jaar.
De nucleaire lamine-eiwitten hebben diverse contacten met filamenteus nucleoskelet, wat zorgt voor een
subnucleaire organisatie van de chromosomen en chromatinecomplexen. Het zijn de aanhachtingspunten
van TADs en LADs. Er is een mozaïek patroon te zien van de nucleaire envelop: nucleaire lamina vs nucleaire
poriën. Het heterochromatine is geassocieerd met de lamina en niet met de poriën. Lamina is waarschijnlijk
een gene silencing platform. De lamina is een soort van bescherming voor het inactief DNA. Bij progeria
patiënten is er iets mis met de splicing, en is de nucleaire envelop onderhevig aan veroudering.
Vraag 5: Verklaar de rol van chromatineveranderingen in nucleaire fluïditeit & fase-scheiding
DNA-condensaten vertonen een reeks fysisch-chemische eigenschappen: terwijl de lange DNA-vezel
geïmmobiliseerd blijft in condensaten, associëren eiwitten zich met verschillende affiniteiten en dynamiek.
Het is verleidelijk om te speculeren dat het continuüm van materiaaleigenschappen de mate van biologische
activiteit langs DNA kan beïnvloeden. Meer vloeibare, dynamische kenmerken zoals gevonden in
transcriptionele condensaten zorgen voor een hogere toegankelijkheid en transcriptionele activiteit langs
de chromatinevezel. Daarentegen zijn de DNA-condensaten geassocieerd met genesilenced-regio's, zoals
heterochromatine, geassocieerd met een grote immobiele fractie van eiwit, bijvoorbeeld HP1α, in het DNA-
condensaat, indicatief voor verminderde dynamiek of visco-elastisch gedrag. Aan het uiterste uiteinde van
het spectrum kan het vermogen van DNA om in vaste of kristallijne toestanden te bestaan voordelig zijn bij
4
