Samenvatting
Samenvatting H4: eiwitten
Deze samenvatting omvat alle noodzakelijke informatie op een gestructureerde manier van de powerpoint van hoofdstuk4, eiwitten. Heeft verduidelijking waar nodig.
[Meer zien]Voorbeeld 3 van de 16 pagina's
Voorbeeld 3 van de 16 pagina's
In winkelwagenVoorbeeld van de inhoud
12.4.1: ISOLEREN VAN EIWITTEN Serine of threonine fosfatasen Natrium fluoride
Natrium pyrofosfaat
- starmateriaal homogeniseren → ruw eiwitlysaat
Tyrosine fosfatasen Natrium orthovanadaat
- samenstelling homogenisatiebuffer voor eiwit:
▪ Buffer: pH ▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer
▪ Zout: niet denatureert & oplost ▪ Bekomen van ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren via:
▪ Protease inhibitoren: niet afbreekt o chromatografie
▪ Fosfatase inhibitoren: fosforylaties geconserveerd blijven o Elektroforese
▪ Detergent: oplossen celmembraanReducerend agens: breken
disulfidebruggen
2.4.2: AANMAAK VAN EIWITTEN
a) protease inhibitoren:
- doel:
Protease familie Protease inhibitoren
Serineproteasen PMSF 1) Wetenschappelijk onderzoek
→ Als serine essentieel is voor katalytische activiteit Benzamidine 2) Farmaceutische industrie
aprotinine 3) Waspoederindustrie
Metalloproteasen EDTA ( binden aan 4) Voedingsindustrie
→metaalionen nodig voor katalytische activiteit metaalionen)
CHEMISCHE SYNTHESE IN VITRO
Cysteïne proteasen Leupeptine
→cysteïne essentieel voor katalytische activiteit - Voordelen:
Aspartaat proteasen Pepstatine ▪ Synthese artificiële eiwitten
→aspartaat essentieel voor katalytische activiteit ▪ Geen problemen toxiciteit organismen
- Nadelen:
▪ Mengsel van meerdere protease-inhibitoren in buffer ▪ duur
▪ Met of zonder EDTA ▪ Kleine #
▪ Per cyclus:
b) fosfatase inhibitoren: o Opbrengst verlagen extra AZ
Fosfatasefamilie Fosfatase inhibitoren o Enkel korte sequenties
o Toepassingen:
, 2
▪ Aanmaak peptiden voor antistoffen ▪ vaak koppelen aan in vitro transcriptie, translatie
▪ Aanmaak artificiële eiwitten ▪ toepassingen:
o karakteriseren van ORF
Synthese van eiwitten door koppelen van peptiden:
o structurele & functionele studies
* einde van peptide linker:
- reactieve groep
IN VIVO EXPRESSIE SYSTEMEN
- reageert enkel met carboxygroep van AZ
▪ expressie van recombinant eiwit komt:
* beschermingsgroepen reacties voorkomen: o na introductie recombinant DNA
= recombinante eiwitproductie
- groen ~ N terminus bescherming
▪ Gekozen organisme:
- rood ~ bescherming zijketens o Bepaalt keuze expressie van plasmide & sequentie
* vrijzittende aminogroep reactie carboxygroep 2e AZ
Codon optimisatie:
* alle AZ ingebouwd:
o Wat:
- klievingsreactie: eiwit losmaken van peptide linker
▪ aanpassen eiwitcoderende DNA sequentie
o waarom:
▪ hogere eiwitexpressie
ENZYMATISCHE SYNTHESE IN VITRO
o waar:
▪ gebruik van reticulocyt ▪ codons waarvoor veel tRNA’s aanwezig zijn
o immature RBC o voorbeeld arganine als codon:
o bevat ribosomen ▪ 22%: AGA human sequentie
o bevat AZ en E ▪ 1 %: AGA E. Coli
o heeft sterk eiwittranslatiemechanisme → E. coli weinig tRNA
o gespecialiseerde aanmaak → moeilijk uit arginine een eiwit bouwen
→ codon optimalisatie nodig
, 3
Transiënte eiwitproductie Stabiele eiwitproductie ▪ PTM:
Transfectie van DNA Transductie van DNA o Bepaald structuur & functionaliteit
= DNA integreert NIET in genoom gastheercel = DNA integreert WEL in genoom ▪ Aggregaten/ inclusion bodies:
Gastcel delen → recombinant verdund Subcultuur aanwezig = slecht gestructureerde eiwitten
Duur: enkele dagen Duur: maanden o Voordelen:
▪ Geen last toxiciteit voor bacterie
▪ Beschermd van proteolyse
▪ Zuiver & hoog geconcentreerd eiwit
IPTG inductie
▪ Laboratoriumschaal vs. Industriële schaal Lac repressor binden op T7.
Kleine volumes grotere volumes ( tanken)
Hierdoor geen transcriptie of
translatie.
Expressiesystemen IPTG bindt Lac repressor & neem
af T7. Hierdoor kan T7 RNA
1) Bacteriële expressiesystemen polymerase binden & translatie
▪ E. Coli: plaatsvinden
o vaak gebruikt
o Bacterie: kapot voor eiwitsecretatie
▪ Bacillus subtilis: Artificiële bacteriële ribosomen ( Ribo-T)
o Eiwitsecretie in medium
o Bacterie: niet kapot voor eiwitsecretatie ▪ Witte ribosoom:
o mRNA transleren voor eiwitaanmaak
▪ Gekleurde ribosoom:
o extra artificiële ribosoom
o Ribo-T: zet kleine & grote SE aan elkaar
o andere Shine-Dalgarno sequentie herkennen:
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper charlotteallaert1. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 79373 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen