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Outils et technique de biologie moléculaire
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Présentation approfondit des outils et technique de base de la biologie moléculaire, indispensable a la pratique en laboratoire
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Préparations des acides nucléiques1) Rappel de la structure des acides nucléiques
- Les sucres = ribose (ARN), désoxyribose (ADN)
- Les bases = Guanine, Adénine, Thymine, cytosine (ADN) , et uracile (ARN)
Sucre + base = nucléoside
Sucre + base + phosphate = nucléotide.
La polymérisation d’un acide nucléique se fait par condensation → libération de 2 phosphate et un H20. Elle se fait
toujours dans le sens 5’→3’. Cette réaction est catalysée par des enzymes de type polymérase.
Structure d’un polynucléotide
Une extrémité 5’ Phosphate et les sucres sont accroche au phosphate par liaison phosphodiester et se termine par
une extrémité 3’OH.
L’appariement entre les bases complémentaires se fait de manière que La base A fait 2 liaison hydrogène avec T ou le
U, et la base C fait 3 liaison hydrogène avec la G.
L’ADN est un modèle en une double hélice qui porte 2brins d’ADN antiparallèle organisé en hélice enroule et des
bases sont liée par des liaison H, sui sont de faible énergie pour la stabilité de l’ADN.
L’ARN est une molécule linéaire, qui a des structures secondaire en épingle à
cheveux ou boucles .il n’existe pas de double hélice d’ARN , il se replie sur lui-même
et sa fonction est définie par ce repliement . EX : ARNr .
2) Méthodes d’extraction et de séparation des acides nucléiques
Les acides nucléiques sont séparés des autres molécules présent dans les cellules en utilisant leurs spécificité
physico-chimique:
- Grande taille, poids moléculaire élevé
- Forte charge négative (phosphates)
- Hydrophylique ou hydrophobique selon le pH, la présence de sel et la concentration.
Deux étapes principales:
- Lyse pour libérer et solubiliser les acides nucléiques
La méthode de lyse doit être adaptée à l’échantillon pour faciliter la purification et préserver l’intégrité des acides
nucléiques. Inclus parfois des enzymes pour dégrader les parties dures de l’échantillons (cellulase, collagénase,
lysozyme, protéinase K…)
- Elimination chimique ou enzymatiques des contaminants
(Protéines, polymères de sucres, autres acides nucléiques, inhibiteurs…). Souvent en plusieurs étapes successives
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, -Lyse avec neutralisation des
enzymes pour éliminer tous ce
qui n’est pas Ac nucléique.
-l’extraction par les solvants
organiques élimine les protéines
qui s’accroche à l’ADN.
-sel et éthanol rendent l’ADN
insoluble qui se descendre en bas
Préparation de plasmide, exemple de la lyse alcaline de bactéries
- Centrifuger les bactéries (E. coli)
- Eliminer le surnageant
- Re suspendre les bactéries dans 250 μl d’eau.
- Ajouter 250 μl d’une solution de 0,2 M NaOH, 1% SDS
- Neutraliser avec 250 μl d’une solution d’acétate de sodium à 3 M pH5,2
- Centrifuger pour éliminer les débris cellulaires.
✓ Le surnageant contient le plasmide qui est purifier par précipitation.
L’extraction par les solvants organiques
• L’ADN est dans la phase
aqueuse si le pH>7,5
• L’ARN est dans la phase
aqueuse si le pH<5
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,Purification sur colonne échangeuse d’anions
- Liaison ionique grâce aux fortes charges négatives de l’ADN.
- Lavage avec une faible concentration de sel (NaCl, KCl...)
- Elution avec une forte concentration de sel
Purification sur colonne de silice (grains de sable)
- Déstabilisation des liaisons hydrogènes en présence d’agent chaotropique (guanidium, perchlorate de lithium, urée
...) qui permet une liaison ionique ou hydrophobe sur la matrice de silice. L’ADN étant chargé négativement (-), va se
lier sur la matrice qui est charge positivement (+).
- Ajout d’agent chaotropique à l’ADN
- Fixation de l’ADN sur la résine de silice
- Lavage avec une solution d’alcool
- Elution avec de l’eau ou 10 mM tris pH 8.
Ultracentrifugations
Basé sur le gradient de densité continu en chlorure de césium.
Mais il y a une utilisation d’une grande quantité de bromure
d’éthidium. (Faible densité en haut, forte densité en bas).
Apres l’ultracentrifugation, il y a prélèvement de la bande
d’intérêts suivie de purification de l’ADN(précipitation). Mais il
faut que l’ADN soit super purifié.
Précipitation des acides nucléiques
Sels → neutralise les charges (-)
Alcool → ADN =hydrophobique =insoluble va précipiter mais tout l’autre
métabolite reste en solution.
Pratiquement tous les sels fonctionnent :
- Sels les plus utilisés : NaCl > 0,2 M /LiCl > 1M/Acétate de Sodium pH 5,2 > 0,3 M
- Alcool utilisés : Ethanol: 2 x vol aqueux /Isopropanol: 0,7 x vol aqueux
Refroidir si la concentration en ADN est faible.
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, Comparaison des méthodes de purification :
- Précipitation:
+ Rapide, rendement élevé, adaptable sur une grande plage de conditions (20ng/ml-10 mg/ml).
- Elimine seulement les molécules solubles, purification insuffisante à partir de lysats brute. Utilisée en finition après
d’autres méthodes ou pour reconcentrer l’ADN.
- Extraction au phénol/chloroforme :
+ Inactive tous les enzymes et élimine toutes les protéines. Séparation ADN/ARN selon le pH.
- Rendement moyen, nécessite d’éliminer les traces de phénol qui peux interférer avec l’utilisation de l’ADN.
Toxique.
→ Suivie d’extraction au chloroforme et/ou précipitation à l’éthanol pour éliminer les traces de phénol.
- Colonnes échangeuses d’ions ou de silice :
+ Assez rapide, bon rendement.
- Séparation partielle des différent acides nucléiques, n’élimine pas toute les protéines (calibré pour une gamme de
quantité étroite ex: midi prép =20-100 μg) .
➔ Les agents chaotropique dénature l’ADN.
➔ Précipitation pour éliminer les sels
- Gradient de chlorure de césium :
+ Acide nucléiques extrêmement pur. Sépare les ADN circulaires, linéaires et les ARN
- Rendement correct si plus de 100 μg d’ADN (ne marche pas pour moins de 20 μg), lent, nécessite du matériel
spécialisé.
→ Précipitation pour éliminer le chlorure de césium, utilisation de bromure d’éthidium.
3) Quantification et analyse des acides nucléiques
Analyse des échantillons d’acides nucléiques
- Mesure du spectre UV grâce au spectrophotomètre, qu’il
faut calibrer d’abord avec un « blanc » = sans acide nucléique.
- Il faut utiliser de l’eau pure ou tampon dilué pour limiter les
interférences et que les échantillons soient préparés dans les
mêmes conditions.
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