Hoofdstuk 3
RNA
DNA vs RNA
DNA RNA
- Ribose; is onstabiel en vatbaar voor afbraak
- Deoxyribose - Uracil
- Thymine - Enkelstrengig; secundaire en tertiaire structuur
- Dubbelstrengig in mogelijk omdat er onderlinge bindingen
dubbele helix kunnen ontstaan
- Langer - Korter
- 2’H - 2’OH; hierdoor is RNA vatbaarder voor afbraak
door RNAsen en daardoor is RNA dus korter
Soorten RNA
● mRNA = coderend messenger RNA, template voor eiwitten (1-4% van het totaalgewicht)
● rRNA = ribosomaal RNA voor verschillende subunits (80-95% van het totaalgewicht)
● tRNA = transfer RNA dat fysische link vormt tussen mRNA en eiwit
● short ncRNA (< 200 nucleotiden)
o miRNA = niet coderend, speelt rol in gezondheid en ziekte
o piRNA = piwi-interacting RNA (interageert met piwi proteïnen), belangrijk in
kiemcellen en dus vruchtbaarheid
o siRNA = short interfering RNA, belangrijk bij genexpressie
● long ncRNA (> 200 nucleotiden)
● Circulair RNA = recent ontdekt, functie nog onbepaald
Structuur mRNA
,Pre- mRNA is heel vluchtig en bevat nog de intronen.
Mature RNA= 5’ gemodificeerde groep, 5’UTR, protein-coding sequence, 3’UTR, poly-A staart
2.3.1 RNA verzorgen en bewaren
● Mogelijke problemen:
– RNA profiel verandert na staalname, bv inductie genen
– RNA degradatie door endogene (in staal) of exogene (van buitenaf) RNAsen
– DNA contaminatie: scheiding DNA/RNA meestal onvolledig
● Staalname:
‒ Keuze anticoagulans (antistollingsmiddel): best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA
reacties met PCR
‒ RNA stabilisatie: RNA degradatie en/of inductie voorkomen:
→ Onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibare stikstof (-196°C). Pas daarna kan je
het DNA stabiliseren.
→ Totaal bloed: vacuümtube met RNA bewaarmiddel, bv PAXgene tube.
→ Cellen/weefsel: RNA bewaarmiddel.
- bv RNAlater (ammoniumsulfaat oplossing). Dit precipiteert eiwitten. Dat betekent dat
de eiwitten gaan neerslaan en zo niet meer RNA kunnen afbreken of wijzigen. Dit
moet je verwijderen voor extractie,.
- of Trizol (= al eerste stap van extractie)
● Staalverwerking: RNAse-vrij werken!
– Zeer zuiver werken: dat betekent labojas en handschoenen om stalen te beschermen,
afgebakende labo/bench-zone voor RNA werk, een RNAse schoonmaakproduct (RNAse ZAP)
gebruiken voor de oppervlakten & pipetten.
‒ RNAse vrije filter-pipettips en plastics
‒ Nuclease-vrije oplossingen/water:
- gefilterd water (Milli-Q), RT-PCR grade water (getest op RNAsen)
- behandeling met RNAse inhibitoren
■ DEPC (diethyl pyro carbonaat, carcinogeen): reageert met amines in
aminozuren, voornamelijk histidine, in de katalytische site van RNAsen en
inhibeert deze (Tris is een amine, en dus werkt DEPC niet in een Tris-buffer)
■ nieuwere RNAse inhibitoren (minder carcinogeen)
● Bewaring
‒ RNAse-vrij water (of TE-buffer, maar EDTA inhibeert RNAse niet. Het inhibeert wel
DNAsen)
‒ bewaring tot 1 jaar op -80°C (minder lang dan DNA)
, ‒ langere bewaring eventueel als alcohol precipitaat
‒ beter: meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie bewaren
● DNA contaminatie
Is niet altijd een probleem, bijvoorbeeld niet wanneer de toepassing onderscheid maakt
tussen DNA/RNA
‒ Detecteren: RTmin controle & Elektroforese
– Verwijderen: DNAse behandeling
‒ DNase toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
‒ DNase knipt dsDNA en ssDNA of alleen dsDNA bij dsDNA-specifieke DNAsen
‒ Inactivatie (hitte) of verwijdering DNAse na behandeling
Het nadeel aan deze behandeling is het mogelijke verlies of degradatie van RNA.
2.3.2 RNA extractie
Methode =
- afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriecultuur, virussen,.....)
- afhankelijk van doel (hoeveel nodig, welke kwaliteit, ...)
Essentiële stappen:
1. Lysis = weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt. Lysaat = vloeistof met inhoud van
gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk.
2. Isoleren = RNA uit het lysaat halen of opzuiveren (zonder eiwitten, eventueel zonder DNA)
3. Oplossen = RNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, daarbij
concentreren.
, Lyseren:
De eerste stap is de extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3) of eiwitten (Hfdst 2.4)
Verschillende methoden, afh. van weefsel/celtype, volume en aantal stalen, moleculen en
toepassing.
- Vaak de toevoeging van remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNAsen, RNAsen,
proteasen.
- De meest gebruikte methode is het toevoegen van detergenten, bv. SDS, Trizol (guanidium
thiocyanaat), guanidium chloride, …
- Snel vriezen en ontdooien maakt de cel kapot: lyseren is het tegenovergestelde van
cryopreservatie om cellen intact/leefbaar te houden.
- mechanische homogenisatie:
‒ pletten in vloeibare stikstof tot poeder in mortier met pestel. wordt gebruikt om weefsel
stuk te maken.
‒ bead-gebaseerde homogenisator: beads (= kralen, keramisch/metaal/glas) + schudden
aan hoge snelheid.
- vloeibare (liquid) homogenisatie:
‒ Dounce homogenisator of “Douncer”: oplossing tussen glazen pestels
‒ voordeel: mild, laat celfracties (organellen) intact
- sonicatie (geluidsgolven):
- nadeel: kan ook DNA/RNA fragmenteren
- gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie
2.3.2.1 RNA extractie met organische solventen
meest gebruikte detergent bij RNA is Trizol
● Trizol = acid (zuur, pH = 4-5)
● Guanidium thiocyanaat – fenol – chloroform
● Guanidium thiocyanaat zorgt voor cel lysis en is een RNAse inhibitor die zou het RNA intact
gaat laten.
● Toevoegen, goed mengen, RNA nu gescheiden van DNA en eiwitten
- organische laag bevat de eiwitten en lipiden
- interfase laag bevat DNA
- waterlaag bevat RNA → kunnen we afnemen en overbrengen naar een andere tube
en zo verder gaan met ofwel alcohol precipitatie ofwel kolomchromatografie
● Voordeel: eenvoudig, goedkoop, zeer goede opbrengst en zuiverheid
