Methoden in biomedisch onderzoek
Hoofdstuk 8: bioluminescentie/fluorescentie
Micro-organismen en diersoorten die licht produceren
Vuurvliegjes en gloeiwormen oxideren luciferine in het achterlijf door het enzyme luciferase waardoor
er licht ontstaat
Kristalkwallen schijnen groen licht doordat UV licht veroorzaakt door snelle vrijzetting van Ca²+ met
fosfoproteïnee aequorine worden omgezet door groen fluorescent proteïne
o Bij 90% van diepzeedieren komt fluorescentie voor
Chemoluminescentie= exotherme reacties waarbij energie niet wordt afgestaan aan omgeving maar
opgenomen door reactieproduct, dit komt in aangeslagen toestand en zal terugkeren naar
grondtoestand door energie in de vorm van licht uit te schijnen bioluminescentie
Fluorescentie= vorm van chemoluminescentie; een fluorofoor of chroom wordt in aangeslagen
toestand gebracht door absorptie van licht en keert terug naar grondtoestand door emissie van licht
met lagere energie
Bioluminescentie
Luciferase kan gebruikt worden als reporter gen
Transfectie/transductie van cellen, weefsels of organismen link met specifiek gen
o Gen expressie (translatie of transductie regulatie bv)
o Cellulaire events gekoppeld aan gen expressie (signaaltransductie of cellulaire respons bv)
Luciferine en ATP worden geoxideerd en met behulp van het enzyme luciferase en magnesium
ontstaat er licht (andere reactieproducten zijn oxyluciferine, AMP, pyrofosfaat en CO2
Fluorescentie
Spectrum van fluorescentie licht is onafhankelijk van de precieze excitatielijn
Door het combineren van kleuringen en filters kan men duidelijke fluorescente beeldvorming doen
van verschillende preparaten
Zeer gevoelige methoden en zeer specifiek wel met een breed spectrum van fluorescente probes
Demping (quenching) gebeurt wanneer aangeslagen fluorescente moleculen terugvallen naar de
grondtoestand zonder emissie van licht (via vibratie, botsing, etc)
o Dynamische demping (botsingen door diffusie met quencher molecules zoals zuurstof of
aromatische amines) vs statische demping (fluorofoor en quencher vormen een stabiel niet-
fluorescent complex)
Bleking (bleaching) verliest een fluorescente molecule zijn fluorescente eigenschappen door te lange
blootstelling aan excitatielicht (licht geïnduceerde chemische schade). Lagere intensiteit van
excitatielicht vertraagt dit proces, zuurstof en vrije radicalen versnellen dit proces (antioxidanten
toevoegen aan medium)
Saturatie treedt op wanneer de intensiteit van het excitatielicht te hoog is tov de levensduur van de
aangeslagen toestand. Fluorescente moleculen blijven in de aangeslagen toestand en kunnen niet
meer aangeslagen worden
, Breedveld epi-fluorescentiemicroscoop (zelfde weg voor excitatie en emissie licht) sterke lichtbron
(LED, kwik of xenon-lamp)
o licht gaat door excitatiefilter om enkel met een specifieke golflengte te exciteren. wordt
gereflecteerd door kleur selectieve spiegel (deze reflecteert korte golflengtes richting
specimen, maar laat lange golflengtes door richting detector) gaat dan door objectieflens en
specimen
o fluorescentielicht van staal gaat door objectieflens en kleur selectieve spiegel, dan gaat het
door emissiefilter filter om enkel licht met de gewenste emissie golflengte te detecteren
o licht wordt gedetecteerd door oog of CCD camera
Confocale fluorescentiemicroscoop (belichting en detectie worden beperkt tot eenzelfde punt in het
specimen dmv 2 pinholes)
o pinhole voor lichtbron om enkel belichting toe te laten van een klein gebied in het focale vlak
van het specimen
o Enkel fluoresentie licht van dit kleine gebied in het focale vlak van het specimen wordt
gefocusseerd door de pinhole voor de detector
o Scherper fluorescentiebeeld door secundaire fluorescentie buiten het focale veld te
verwijderen
2-foton fluorescentiemicroscoop
o hoge output infrarood laser met gesplitste lichtbundel laten samenkomen op een punt in
het specimen
o 2 simultane infrarood fotonen geven zelfde energie als 1 UV foton om excitatie te bekomen
excitatie gebeurt dus alleen in het punt waar de twee lichtbundels samenkomen
FRET (fluorence resonance energy transfer)
o Energieoverdracht door resonantie kan optreden wanneer donor- en acceptormoleculen 1-10
nm van elkaar zijn en emissie / excitatie spectra van donor en acceptor overlappen
o Energieoverdracht gebeurt niet door straling (donor zendt geen foton uit dat door de
acceptor wordt geabsorbeerd) => extra mogelijkheid voor energie afgifte van door licht
geëxciteerd elektron
Intensiteit fluorenscentielicht donor daalt
Levensduur geëxciteerde toestand donor wordt korter
Intensiteit fluorenscentielicht acceptor neemt toe
o Spectrum van het fluorescentielicht door de moleculaire combinatie verschuift naar lagere
energie (langere golflengte)
FLIM (fluorescence lifetime imaging) doet aan het meten van de levensduur van de aangeslagen
toestand en niet de intensiteit van het fluorescentielicht
o Scheiden van fluoroforen met een gelijkaardig spectrum (elk fluorofoor heeft een unieke
levensduur van de aangeslagen toestand)
o Levensduur van de aangeslagen toestand van een fluorofoor wordt bepaald door zijn
omgeven (proteïne - proteïne interacties, pH, water concentratie etc)
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) wordt gebruikt voor het meten van moleculaire
diffusie en tijdsafhankelijke processen
Hoofdstuk 8: bioluminescentie/fluorescentie
Micro-organismen en diersoorten die licht produceren
Vuurvliegjes en gloeiwormen oxideren luciferine in het achterlijf door het enzyme luciferase waardoor
er licht ontstaat
Kristalkwallen schijnen groen licht doordat UV licht veroorzaakt door snelle vrijzetting van Ca²+ met
fosfoproteïnee aequorine worden omgezet door groen fluorescent proteïne
o Bij 90% van diepzeedieren komt fluorescentie voor
Chemoluminescentie= exotherme reacties waarbij energie niet wordt afgestaan aan omgeving maar
opgenomen door reactieproduct, dit komt in aangeslagen toestand en zal terugkeren naar
grondtoestand door energie in de vorm van licht uit te schijnen bioluminescentie
Fluorescentie= vorm van chemoluminescentie; een fluorofoor of chroom wordt in aangeslagen
toestand gebracht door absorptie van licht en keert terug naar grondtoestand door emissie van licht
met lagere energie
Bioluminescentie
Luciferase kan gebruikt worden als reporter gen
Transfectie/transductie van cellen, weefsels of organismen link met specifiek gen
o Gen expressie (translatie of transductie regulatie bv)
o Cellulaire events gekoppeld aan gen expressie (signaaltransductie of cellulaire respons bv)
Luciferine en ATP worden geoxideerd en met behulp van het enzyme luciferase en magnesium
ontstaat er licht (andere reactieproducten zijn oxyluciferine, AMP, pyrofosfaat en CO2
Fluorescentie
Spectrum van fluorescentie licht is onafhankelijk van de precieze excitatielijn
Door het combineren van kleuringen en filters kan men duidelijke fluorescente beeldvorming doen
van verschillende preparaten
Zeer gevoelige methoden en zeer specifiek wel met een breed spectrum van fluorescente probes
Demping (quenching) gebeurt wanneer aangeslagen fluorescente moleculen terugvallen naar de
grondtoestand zonder emissie van licht (via vibratie, botsing, etc)
o Dynamische demping (botsingen door diffusie met quencher molecules zoals zuurstof of
aromatische amines) vs statische demping (fluorofoor en quencher vormen een stabiel niet-
fluorescent complex)
Bleking (bleaching) verliest een fluorescente molecule zijn fluorescente eigenschappen door te lange
blootstelling aan excitatielicht (licht geïnduceerde chemische schade). Lagere intensiteit van
excitatielicht vertraagt dit proces, zuurstof en vrije radicalen versnellen dit proces (antioxidanten
toevoegen aan medium)
Saturatie treedt op wanneer de intensiteit van het excitatielicht te hoog is tov de levensduur van de
aangeslagen toestand. Fluorescente moleculen blijven in de aangeslagen toestand en kunnen niet
meer aangeslagen worden
, Breedveld epi-fluorescentiemicroscoop (zelfde weg voor excitatie en emissie licht) sterke lichtbron
(LED, kwik of xenon-lamp)
o licht gaat door excitatiefilter om enkel met een specifieke golflengte te exciteren. wordt
gereflecteerd door kleur selectieve spiegel (deze reflecteert korte golflengtes richting
specimen, maar laat lange golflengtes door richting detector) gaat dan door objectieflens en
specimen
o fluorescentielicht van staal gaat door objectieflens en kleur selectieve spiegel, dan gaat het
door emissiefilter filter om enkel licht met de gewenste emissie golflengte te detecteren
o licht wordt gedetecteerd door oog of CCD camera
Confocale fluorescentiemicroscoop (belichting en detectie worden beperkt tot eenzelfde punt in het
specimen dmv 2 pinholes)
o pinhole voor lichtbron om enkel belichting toe te laten van een klein gebied in het focale vlak
van het specimen
o Enkel fluoresentie licht van dit kleine gebied in het focale vlak van het specimen wordt
gefocusseerd door de pinhole voor de detector
o Scherper fluorescentiebeeld door secundaire fluorescentie buiten het focale veld te
verwijderen
2-foton fluorescentiemicroscoop
o hoge output infrarood laser met gesplitste lichtbundel laten samenkomen op een punt in
het specimen
o 2 simultane infrarood fotonen geven zelfde energie als 1 UV foton om excitatie te bekomen
excitatie gebeurt dus alleen in het punt waar de twee lichtbundels samenkomen
FRET (fluorence resonance energy transfer)
o Energieoverdracht door resonantie kan optreden wanneer donor- en acceptormoleculen 1-10
nm van elkaar zijn en emissie / excitatie spectra van donor en acceptor overlappen
o Energieoverdracht gebeurt niet door straling (donor zendt geen foton uit dat door de
acceptor wordt geabsorbeerd) => extra mogelijkheid voor energie afgifte van door licht
geëxciteerd elektron
Intensiteit fluorenscentielicht donor daalt
Levensduur geëxciteerde toestand donor wordt korter
Intensiteit fluorenscentielicht acceptor neemt toe
o Spectrum van het fluorescentielicht door de moleculaire combinatie verschuift naar lagere
energie (langere golflengte)
FLIM (fluorescence lifetime imaging) doet aan het meten van de levensduur van de aangeslagen
toestand en niet de intensiteit van het fluorescentielicht
o Scheiden van fluoroforen met een gelijkaardig spectrum (elk fluorofoor heeft een unieke
levensduur van de aangeslagen toestand)
o Levensduur van de aangeslagen toestand van een fluorofoor wordt bepaald door zijn
omgeven (proteïne - proteïne interacties, pH, water concentratie etc)
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) wordt gebruikt voor het meten van moleculaire
diffusie en tijdsafhankelijke processen
