He1senberg Samenvatting Universiteit Gent
Moleculaire biologie I
(C003362)
Academiejaar: 2022-2023
Lesgever: W. Declercq
,2
,Inleiding tot de moleculaire biologie 04
DNA: algemene eigenschappen 10
Replicatie 21
Mutaties, herstel en recombinatie 45
Transcriptie 63
Translatie 76
Referenties
› Ufora PowerPoints
› 978-0-321-76243-6
› 978-1-292-40479-0
› 978-0-7167-7601-7
› 978-0-3938-8482-1
› 978-1-55581-952-1
› 978-1-55581-976-7
3
, Hoofdstuk 1
Inleiding tot de moleculaire biologie
Het biologische universum
Prokaryoten
❖ Geen kernmembraan/organellen
❖ Vroeger benoemd naar fysische uitzicht
❖ mRNA synthese en translatie gelijktijdig
Eubacteriën
❖ Gram-positief/negatief
➢ G+
▪ Hebben een dikke peptidoglycaanlaag die ondoordringbaar is voor het
alcoholmengsel, waardoor deze niet worden ontkleurd. (blauw)
➢ G -
▪ Hebben een periplasmatische ruimte maar een dunne peptidoglycaanlaag (rood)
▪ Bevatten op hun buitenste membraan lipopolysacchariden (LPS) die verantwoordelijk
zijn voor hun pathogeniciteit
▪ Periplasmatische ruimte wordt gebruikt bij genetic engineering omdat eiwitten uit
cytosol halen moeizamer gaat.
Archae
❖ Leven in extreme omstandigheden
❖ Meer verwant met eukaryoten dan met eubacteriën (rRNA, RNAP)
Eukaryoten
❖ Nucleair membraan (ribosomen scheiden van DNA)
❖ Organellen (mitochondriën, chloroplasten, golgi, ER,…)
➢ Mitochondriën en chloroplasten vinden hun oorsprong in een symbiose tussen eubacteriën
en vroege eukaryoten
4
,Overzicht van de moleculaire biologie
❖ wetten van Mendel (vroege twintigste eeuw)
❖ Thomas Hunt Morgan (relatie tussen gen en chromosoom)
❖ Luria-Delbrück (bacteriofagen om overerving te bestuderen)
➢ Mutation hypothesis of acquired immunity hypothesis
➢ Fluctuatietest
❖ 1883: Strassburger: basis van de erfelijkheid in nucleus
❖ 1924: Feulgen: DNA voldoet aan de criteria om als erfelijk materiaal te fungeren
❖ Watson & Crick (1953)
❖ 1970: Eerste humane gen tot expressie in bacteriën
❖ …
Unitair karakter van de biochemie van de levende wezens
Genetische informatiestroom
Macromoleculen
❖ DNA
➢ 4 deoxyribonucleotiden (2 purinen A, G en 2 pyrimidinen C, T)
➢ Uracil ipv Thymine bij bacteriofagen
❖ RNA
➢ 4 ribonucleotiden
➢ T -> U, CH3 -> H, Deoxyribose -> ribose: 2'H -> OH
❖ Eiwit
➢ Maximaal 20 verschillende aminozuren
➢ Andere aminozuren ten gevolge van secundaire modificaties
➢ Afwijkende aminozuren (bv. afkomstig van planten) zijn toxisch
➢ Bestaan in L- (in eiwitten) of D- (in celwand van bacteriën en planten) vorm
5
,Genetische code
❖ Codon = 3 basen
❖ 64 (4x4x4) mogelijkheden voor 20 AZ
❖ Start: AUG (,GUG, UUG) en Stop: UAG, UAA, UGA
❖ Methionine altijd ingebouwd, cfr. initiator tRNA
❖ Codons zijn identiek voor bacteriën, planten en dieren.
➢ Afhankelijk van het organisme is er echter wel een voorkeur voor een bepaald codon per
aminozuur
➢ Ook een afwijking op het codongebruik bij mitochondriën doordat de geproduceerde
tRNA's verschillend zijn dan deze van het cytosol
Intermediair metabolisme & ATP
❖ Geconserveerde pathways zoals glycolyse en citroenzuurcyclus
Enkele conventies, definities en begrippen
❖ Bij het noteren van DNA of RNA sequenties gelden er enkele conventies:
➢ Van links naar rechts in de 5' (fosfaat) naar de 3' (OH) richting
➢ Enkel de coderende/sense streng (=mRNA seq.) genoteerd
➢ Indien als dubbelstrengig genoteerd is bovenste 5' -> 3'
❖ Leesraam
➢ Elke opeenvolging van nucleotiden in DNA/RNA die per drie gelezen wordt
❖ Open leesraam (ORF)
➢ Een DNA/RNA-sequentie, per drie nucleotiden gelezen, die begint met een startcodon en
eindigt met een stopcodon.
❖ Coderende sequentie
➢ Een ORF dat in eiwit wordt vertaald.
➢ Niet elk gen bevat een ORF, bv. rRNAs en microRNAs
➢ mRNA-sequenties stroomop- en af-waarts van het ORF noemen 5' en 3' UTR (untranslated
regions)
▪ Stroomopwaarts en afwaarts is relatief ten opzichte van het gen (afhankelijk van waar
promotor zich bevindt)
❖ Gen
➢ Een bepaalde lengte van DNA die de synthese codeert en dirigeert van een eiwit of RNA
❖ Essentiële genen
➢ Genen die absoluut noodzakelijk zijn voor de leefbaarheid en groei van een cel, onder alle
omstandigheden (Housekeeping genes)
❖ Operon
➢ Meerdere (structurele) genen, expressie gereguleerd, vanuit één promotor, operator of
activator-bindende sequenties.
➢ Komen enkel voor bij prokaryoten
▪ Polycistronische mRNA
❖ Soorten mutaties
➢ Puntmutaties
➢ Non-sense mutaties (mutatie tot stop-codon)
➢ Missense mutaties (andere AZ)
➢ Knock-out mutaties
➢ Stille mutaties (zelfde uitkomst (vb. wobble-base)
❖ Oligonucleotide
➢ een kort polynucleotide
❖ Transformatie
➢ Het introduceren van DNA door het opmengen van cellen en DNA
➢ Bij eukaryoten = transfectie
❖ Transductie
➢ Het proces waarbij DNA niet afkomstig van de faag wordt geïntroduceerd in een cel door
infectie van de cel met deze faag
6
,Het E.coli modelorganisme
Groeicondities
❖ Veel glucose, best aeroob
E. Coli celdeling
❖ Snelle celdeling gebeurt enkel in optimale groeiomstandigheden van temperatuur (37°C) en
voedingsbodem
❖ 40 minuten delingstijd, in vergelijk met 16-24h bij eukaryote cellen
Snelheid van DNA, RNA en eiwitsynthese in E. Coli
❖ DNA
➢ Steeds dezelfde tijd om één molecule te maken (41-46 min)
➢ tetraploïd (20min), diploïd (40min) en haploïd (arm milieu)
➢ 50 000 bp/min/synthesepunt, bij mens slechts 2000-10000 bp/min/synthesepunt
❖ RNA
➢ Snelheid RNA synthese is gelijk voor prokaryoten en eukaryoten (~60 nucleotiden/s)
➢ Onafhankelijk van stam maar wel van initiatiefrequentie
❖ Eiwit
➢ Sterk afhankelijk van temperatuur (bv. E. Coli 37°C -> 10-30 AZ/sec)
➢ Eukaryote eiwitsynthese trager (bv. Konijn -> 4 AZ/sec), doordat:
➢ Transcriptie gebeurt cotranslationeel
Chemische samenstelling van E. Coli
❖ Volume: 2 µm3
➢ Dichtheid: 1,1 g/cm3
❖ Gewicht: 2.10-12 g = 1012 Dalton
➢ Water (70%), Anorganische ionen (1%), Koolhydraten (3%), Aminozuren (0,4%), nucleotiden
(0,4%), vetten (2%)
❖ DNA (1%)
➢ 4,6.106 bp
➢ 2758 genen
➢ 85% van genoom coderend voor eiwitten
▪ (Bij hogere eukaryoten is deze fractie veel kleiner)
❖ Eiwitten (15%)
➢ 4 miljoen moleculen
➢ Functionele eiwitten: 2 miljoen
➢ 2500 polypeptiden
➢ Grote heterogeniteit tussen verschillende eiwitten
❖ RNA (6% fluctuerend)
➢ 6.1010 Da
➢ Steady-state: rRNA 80%, tRNA 15%, mRNA 3-5%
➢ Tijdens synthese: tRNA: 50%, mRNA+rRNA 50%
Ex: hoe kan men berekenen hoeveel eiwitten er tegelijkertijd kunnen aangemaakt worden?
➔ Afhankelijk van hoeveelheid rRNA er aanwezig is (lesopname 11/10 – 09:30)
RNA
❖ rRNA
➢ 30 000 ribosomen per cel (max. want polysomen bestaan ook)
➢ 7 genkopijen met stille mutaties
➢ TANDEM arrangement (+ over verschillende chromosomen)
➢ Grote metabolische stabiliteit van rRNA
❖ tRNA
➢ 4.105 moleculen/cel
➢ 8700 moleculen per tRNA
➢ Aminoacyl-tRNA
7
,❖ mRNA
➢ +/- 3000 nucleotiden
➢ Elke mRNA molecule zal informatie dragen voor meer dan 1 eiwit = polycistronische mRNA
➢ Een cistron= een eenheid van genetische informatie waarbij men twee onafhankelijke
mutanten niet kan complementeren met elkaars DNA (trans-configuratie). Dit wijst er dan op
dat de mutatie in hetzelfde cistron (of gen) voorkomt. = DNA sequentie die codeert voor
één polypeptideketen
➢ Een operon= Een stuk DNA dat wordt overgeschreven als één continue RNA molecule en
verschillende cistronen (genen) bevat.
➢ Cis-trans complementatietest:
▪ Bepalen of twee recessieve mutaties die aanleiding geven tot eenzelfde fenotype al dan
niet op dezelfde functionele eenheid gelegen zijn (cis) of niet (trans)
➢ Structuur fundamenteel verschillend bij prokaryoten en eukaryoten
▪ + Minder promotors, terminators, repressors, activators nodig
▪ + ter gelijkertijd aan/uit
▪ + constante onderlinge verhouding
▪ Nadeel: Onderlinge verhouding vraagt aparte translationele regulatie. In
monocistronische multicellulaire organismen moet de genexpressie fijner kunnen
gereguleerd worden afhankelijk van het celtype.
8
, Het Lac-operon
EX: Hoe zou je kunnen aantonen dat de repressor in het lac- operon in trans werkt en de
operator in cis?
1. Mutant gen produceert continu eiwitten, want er is geen repressie
2. Wild-type (wt) chromosoom wordt in de cel gebracht
3. Deze wt zal normaal/actieve repressor produceren
4. Repressor bindt ook op mutante streng waardoor eiwitexpressie wordt geïnhibeerd
-> verandert fenotype
5. Door een mutatie in de operator kan de repressor niet binden, hierdoor wordt continu
eiwit geproduceerd.
6. Een wt-gen wordt binnengebracht in de cel (,deze zal zijn eigen operator represseren)
7. Het mutante gen zal nog steeds eiwit produceren omdat de repressor nog steeds niet
kan binden op de operator (mutatie)
-> onveranderd fenotype
9
