Samenvatting
Samenvatting theorie en practica moleculaire diagnostiek (notities, ppt, cursus, afbeeldingen)
- Instelling
- Hogeschool Gent (HoGent)
Samenvatting theorie en practica (notities, ppt, cursus, afbeeldingen)
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 39 pagina's
Voorbeeld 4 van de 39 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
Samenvatting moleculaire diagnostiek1 Kwantitatieve PCR (qPCR)
1.1 Verschil tussen conventionele – en qPCR
Conventionele PCR qPCR
Detectie tijdens plateaufase, dus na afloop Detectie in real time: elke cyclus wordt de
PCR-reactie en meerdere cycli hoeveelheid PCR-product gemeten
Niet kwantitatief: veel variatie Kwantitatief
Kenmerken qPCR:
- Na of tijdens elke cyclus wordt gemeten hoeveel
PCR-product er is aangemaakt
- De PCR-producten zijn fluorescerend door binding
aan een fluorescente kleurstof of probe →
hoeveelheid fluorescentie ~ hoeveelheid van het
gevormde PCR-product
Voordelen qPCR:
- Het PCR-product moet na afloop van de reactie niet meer geanalyseerd worden
door bv. gelelektroforese → minder contaminatie doordat reactievaatje niet meer
geopend moet worden
- Mogelijkheid tot kwantificatie startmateriaal doordat hoeveelheid gevormd PCR-
product kan bepaald worden tijdens exponentiële fase
- Meerdere kleuren fluorescentie kunnen gedetecteerd worden → multiplex
toepassingen: meerdere targets in 1 reactie
Principe qPCR:
1. Denaturatie target
2. Anealing → binding primers
3. Extentie → aanmaak PCR-product en ontstaan
fluorescentiesignaal door:
▪ Binding fluorescerende DNA-bindende
kleurstoffen
▪ Afbraak hydrolisatieprobe
→ Elke cyclus zal er meer PCR-product en fluorescentie waarneembaar zijn:
o S-vormige curve
o Cyclus 1: weinig aanmaak en weinig fluorescentie
o Cyclus N: sterke toename hoeveelheid PCR-product en
fluorescentie → EXPONENTIËLE AMPLIFICATIE
o Cyclus 20-40: reactiecomponenten uitgeput en gevormde PCR-
producten remmen reactie → nauwelijks nog toename
hoeveelheid PCR-product en fluorescentie:
PLATEAUFASE
,1.2 Fluorescentie: detectie
Fluorochromen
= Moleculen die energie in de vorm van licht kunnen opnemen
1. Excitatie
2. Emissie: andere golflengte door verlies van een deel van de
energie
→ Opgelet: spectrale overlap
o Voor elk fluorochroom een kanaal met optimale golflengte
om te gaan meten
o Maxima mooi gescheiden
o Zo weinig mogelijk van een ander kanaal oppikken
1.3 Directe qPCR detectiemethoden
Door middel van fluorescerende DNA-intercallerende kleurstoffen (binden aan
dsDNA waardoor fluorescentie toeneemt):
- Ethidiumbromide (vroeger):
o Veel nadelen:
▪ Hoge achtergrondfluorescentie
▪ Mutageen
- SybrGreen (nu):
o Voordelen:
▪ Lagere achtergrondfluorescentie: ongebonden bijna geen
fluorescentie
▪ Voor elke PCR
o Nadelen:
▪ Niet specifiek: bindt ook ongewenste PCR-producten
1.4 Indirecte detectiemethoden
- Specifieker
- Enkel fluorescentie indien gebonden aan PCR-product door gebruik quencher
- 2 primers + probe (= gelabeld stukje ssDNA, complementair aan amplicon)
1.4.1 Hydrolyse probe, dual labelled probe of TaqMan probe
Principe:
1. Hybridisatie probe aan specifiek PCR-product
2. Extensie: door de 5’3’ exonucleaseactiviteit van Taq
DNA-polymerase wordt de probe afgebroken en
worden de nucleotiden 1 voor 1 verwijderd → toename
afstand tussen quencher en reporter/fluorochroom →
daling uitdovend effect → toename fluorescentie
→ Meting fluorescentie tijdens extentiefase
→ Soms binding MGB (minor groove binder) eiwit aan
3’-uiteinde:
o Binding versterkt: hogere Tm
o Kortere probes
, o Betere signaal-ruis verhouding
o Beter onderscheidend vermogen
o Tm probe gemakkelijk aanpassen
1.4.2 Molecular beacon probe
Principe:
1. Hairpin structuur via complementariteit waardoor quencher en reporter dicht bij
elkaar zitten
2. Anealing: hybridisatie obv complementariteit en energetisch gunstiger →
quencher en reporter verder uit elkaar → toename fluorescentie
3. Taq polymerase: verwijdeering probe (geen afbraak want geen vrij 5’ uiteinde) →
opnieuw hairpin structuur → geen fluorescentie
→ Meting fluorescentie tijdens anealing
Toepassingen: Multiplex toepassingen en mutatie-analyse
- Voordeel: zeer specifiek
- Nadeel: nauwkeurige bepaling dissociatie E maakt ontwerp moeilijk
1.5 Multiplex qPCR
Conventioneel:
- Verschillende fragmentlengtes
- Analyse via agarosegel
qPCR:
- Probes met verschillende fluorochromen
- Kleur ~ welk PCR-product is gesynthetiseerd
- 4 verschillende amplimeren → 4 verschillende primerparen → 4 verschillende
probes
1.5.1 Spectrale overlap emissiespectra
Spectrale overlap tussen fluorochromen:
Filters:
- Laten soms een beetje ander signaal door
- Overstralen: vals + resultaat
Fluorochromen scheiden obv emissie eigenschappen:
- Kalibratie
- Primers/probes niet complementair
- Gelijke Tm primers onderling
- Gelijke Tm probes onderling
- Tm 5-10°C > Tm primers
, 1.6 Genotyperen met molecular beacons
Molecular beacons:
- Zeer specifiek
- Speciaal ontwikkeld voor SNV-analyse
- Geen signaal indien geen 100% overeenkomst met target DNA: door hairpin
structuur vouwt de probe zich terug op indien deze niet voor 100% past
- 2 beacons nodig: 1 complementair aan ene allel en een aan andere allel
1.7 Detectie, analyse en kwantificering van qPCR-producten
1.7.1 Drempelwaarde (treshold) en Cq waarde
Treshold:
- Niveau vanaf waar alles als positief beschouwd wordt
- Grens tussen achtergrondfluorescentie en
fluorescentie door ontstaan PCR-producten
Cq:
- Cyclus waarbij staal positief wordt
- Waar drempelwaarde en PCR-amplificatiecurve
elkaar snijden
- Hoe lager de Cq, hoe meer target materiaal en
hoe minder cycli nodig
1.7.2 Efficiëntie qPCR
Afhankelijk van:
- Remmende stoffen of inhibitoren zoals ethanol, heparine, …
- Lengte target
- Secundaire structuur (hairpin) target
- Beschikbare PCR-componenten
→ Door bepalen efficiëntie: variabelen optimaliseren en effect verschillende
variabelen bepalen
Bepalen efficiëntie:
Standaardcurve 10-voudige verdunningen:
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper iamMLTer. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,09. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 66579 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen