VETERINAIRE VOLKSGEZONDHEID 2
DEEL PROF COVACI: ANALYTISCHE & VOEDSEL- EN MILIEUCHEMIE
,Analytische chemie
1 Inleiding
Het doel van analytische chemie is het verzamelen van theoretische en praktische gegevens om inzicht te krijgen in de
chemische samenstelling van materie, zowel kwalitatief als kwantitatief.
Een kwalitatieve analyse heeft als doel om bepaalde bestanddelen (analieten) te identificeren, detecteren of aantonen
boven een bepaalde concentratiegrens (afhankelijk van de methode). Dit kan bijvoorbeeld bij een speekseltest (roadside
testing) of zwangerschapstest.
• Het probleem hierbij is dat de aanwezigheid van sommige (kleine) componenten onder een bepaalde grens niet
kan worden aangetoond, en daarvoor is sporenanalyse nodig.
Een kwantitatieve analyse heeft als doel om informatie te verzamelen over de hoeveelheid (gehalte, concentratie) van
één, meerdere of alle bestanddelen in een staal. Het gaat hierbij om de vraag in welke concentratie de bestanddelen
aanwezig zijn.
• De meting van een fysische of fysico-chemische grootheid (signaal) is evenredig met de hoeveelheid van het te
doseren bestanddeel, vb. lichtabsorptie → 𝑆 = 𝑓(𝐶) 𝑜𝑓 𝑆 = 𝑘 × 𝐶
• De meting is afhankelijk van de gevoeligheid van de methode en levert kwantitatieve gegevens op.
2 Belangrijke termen
Selectiviteit: De analysemethode moet in staat zijn om de analyt(en) van belang te onderscheiden van endogene
componenten in de matrix of andere componenten in het monster.
• vb. ion-selectieve elektroden die selectief zijn voor Li+, Na+ en K+ in een bloedanalyse.
Specificiteit: Een methode is specifiek wanneer deze enkel en alleen reageert met het bestanddeel dat men wil bepalen.
Door het aanpassen van de methodevoorwaarden kan de specificiteit worden verhoogd.
• vb. een methode die specifiek is voor Li+, maar niet voor Na+ en K+.
Gevoeligheid: De gevoeligheid van een methode wordt gedefinieerd als de helling van de ijkcurve meetsignaal versus
concentratie. Het signaal gemeten per eenheid van concentratie is de richtingscoëfficiënt van de calibratiecurve. Dit
kan worden weergegeven als 𝑆 = 𝑘 × 𝐶 𝑜𝑓 𝑘 = 𝑆⁄𝐶
Detectielimiet: De detectielimiet (limit of detection – LOD) is van analytisch belang
aangezien hierbij naast de signaalgrootte ook de achtergrondruis (apparatuur blanco)
in beschouwing wordt genomen. De detectielimiet wordt gedefinieerd als de
concentratie die aanleiding geeft tot een signaal/ruis verhouding van 3.
Kwantificatielimiet: De kwantificatielimiet (limit of quantification – LOQ) is van
analytisch belang aangezien dit meestal de ‘rapporteringswaarde’ van de methode is. De
kwantificatielimiet wordt gedefinieerd als de concentratie die aanleiding geeft tot een
signaal/ruis verhouding van 10.
1
,Blancobepaling: Blancobepaling meet het gedeelte van het totaalsignaal dat niet te wijten is aan het te doseren
bestanddeel. Dit kan op verschillende manieren, zoals de y-interceptie van de ijklijn (calibratiecurve), reagensblanco of
een combinatie van beide.
• vb. absorptiebijdrage van de solventen en reagentia in spectrofotometrie
• vb. de spontane hydrolyse van substraten bij enzymdoseringen.
Precisie: Precisie is de maat voor de reproduceerbaarheid van de meting. Het kan worden weergegeven als
herhaalbaarheid (dezelfde dag – within day) en intermediaire precisie (verschillende dagen – between-day). Het wordt
uitgedrukt in een percentage als relative standard deviation (RSD) of variatiecoëfficient (VC). Een lage RSD duidt op een
goede precisie en een grote RSD duidt op een lage precisie.
Accuraatheid: Accuraatheid is de maat voor de afwijking van de meting van de werkelijke waarde. De absolute fout is
de maat voor de accuraatheid. Accuraatheid kan worden gecontroleerd m.b.v. andere onafhankelijke methoden en
gecertificeerde waarden voor het te meten bestanddeel. Niet alle bestanddelen hebben echter gecertificeerde
waarden.
Valideren: Valideren is het controleren van een waarde of methode. Alle specifieke delen van de methode moeten aan
bepaalde criteria voldoen (vb. een precisie van minder dan 10% of het bereiken van een bepaalde LOD).
Bij interlaboratorium testen wordt de overall prestatie van de methode wordt getest door externe instanties.
Er zijn verschillende fysische en fysico-chemische instrumentele methoden, waaronder:
• Optische methoden voor de interactie tussen materie en straling
• Elektro-chemische methoden voor de interactie tussen chemische en elektrische verschijnselen,
• Chromatografische methoden voor scheidingstechnieken in combinatie met een detector voor
analysetechnieken
• Radio-chemische methoden die radio-isotopen gebruiken in analyseprocessen of radioactiviteit opwekken.
2
,3 Kalibreren
Het kalibreren van meetapparatuur gebeurt m.b.v. standaarden met een gekend meetsignaal → vb. analytische balans
: een onbelast nulpunt of een ijkgewicht. Bij de huidige apparaat gebeurt het bijna automatisch.
Het kalibreren van methoden gebeurt door een kalibratiecurve te maken met een gemeten signaal (S) en de
concentratie (c) van het te doseren bestanddeel (analiet) → 𝑆 = 𝑘𝑐 + 𝑏 𝑜𝑓 𝑆 = 𝑘𝑐
• Limit of linearity – LOL is het punt waar de curve begint te buigen. Dit kan je oplossen door een andere
methoden te gebruiken of door de concentratie te verdunnen.
3.1 Externe kalibratie
1. ijklijn (kalibratiecurve)
We gaan het signaal meten bij het toepassen van een analyseprotocol op een verdunningsreeks. We gebruiken minstens
3 oplossingen, bij voorkeur meer (5-7).
• vb. een serie standaardoplossingen met een toenemende en steeds gekende concentratie
Standaard voor een kalibratie :
• Gekende concentratie van het analiet
• Gekende zuiverheid & stabiliteit (vb. niet hygroscopisch)
o Een hygroscopische stof is een stof die waterdamp uit de lucht aantrekken
• Makkelijk om te gebruiken en beschikbaar
• De matrix is gelijkaardig met de staal
o vb. bodem, water
o in oplossing
o pH, ionische sterkte, viscositeit, …
Het opstellen van een kalibratie curve :
1) Bereidt de standaard (verschillende concentraties) en blanco oplossingen voor.
2) Analyseer de standaarden (3+) en de blanco(s).
3) Trekt het gemiddelde signaal van de blanco af van het gemiddelde signaal voor elke standaard → blanco
correctie
4) Teken een “blanco-gecorrigeerde” kalibratie curve.
5) Teken een curve tussen de punten (meestal een lijn (linear fit).
6) Gebruik de resulterende vergelijking (equation) om concentraties in onbekende stalen te berekenen.
7) Plot het signaal vs. de concentratie van het analiet (voor meerdere concentraties).
8) Plaats de curve tussen de verschillende punten (lineair of niet-lineair)
9) Meet het signaal van de onbekende staal en extrapoleer de concentratie van de onbekende m.b.v. de curve
3
,Er mogen geen grote verschillen zijn tussen de andere componenten (dus niet de analieten) in de standaarden en in het
staal. De blanco wordt gebruikt om het achtergrondsignaal/ruis te elimineren. De instrumentatie moet stabiel zijn
(signaal vs. tijd is constant). De matrix kan ook belangrijk zijn
2. éénpuntskalibratie
Vergelijken van SX met één punt van de kalibratiecurve.
Het nadeel is dat slechts één standaard wordt meegenomen. Indien deze verkeerd is, wordt eerst de lineariteit gecheckt,
daarna checkt men of de concentratie in het lineaire bereik zit.
Het punt van de kalibratiecurve moet zo dicht mogelijk bij de te meten concentratie liggen.
• 𝑆𝑋 = 𝑘 × 𝐶𝑋
𝑆 𝐶 S = signaal (oppervlakte, intensiteit)
o → 𝑋⁄𝑆 = 𝑋⁄𝐶
𝑆 𝑆 k = response factor
• 𝑆𝑆 = 𝑘 × 𝐶𝑆
Corrigeren voor de blanco :
Blanco-oplossingen zijn oplossingen die reagentia en solventen bevatten, maar geen analiet. Ze worden gebruikt om de
analytische respons (signaal) op onzuiverheden en interferenties in reagentia te meten en correcties uit te voeren. Het
is belangrijk om optimale blanco's te gebruiken die gecorrigeerd zijn voor solvens- en reagentia-effecten, en interacties
tussen analieten en de staalmatrix.
Er zijn verschillende soorten blanco-correcties, waaronder de calibratieblanco (CB) zonder matrix en de reagensblanco
(RB) zonder analiet.
3.2 Interne kalibratie
1. interne normalisatie
Bij een interne normalisatie is de procentuele samenstelling gevraagd → som van alle signalen na correctie voor verschil
in gevoeligheid = 100% ; van elk signaal moet de procentuele bijdrage berekend worden
• vb. vetzuursamenstelling van margarines ; alcoholgehalte in sterke dranken
4
,4 Optische analysemethoden
4.1 Inleiding
Elektromagnetische straling is een brede band van straling, gaande van kosmische golven tot radiogolven. Licht wordt
gedefinieerd als het deel van het elektromagnetische spectrum, dat gedetecteerd wordt met het blote oog. De term
wordt echter ook gebruikt voor straling die zich net buiten het zichtbare gebied bevindt, zoals infrarood (IR) en
ultraviolet (UV) licht. Interactie van elektromagnetische straling met materie kan worden beschreven m.b.v. de
quantumtheorie, waarbij straling wordt opgevat als een stroom fotonen.
4.2 Elektromagnetisch spectrum
Het elektromagnetisch spectrum het een enorm golflengtebereik
• Zichtbaar licht : 400 - 800nm
• UV : 200 - 400nm
• Infrarood : 800 - 106 nm
In de opstelling bestraal je de materie met een gekozen licht en meet je het doorgelaten licht. Het verschil in intensiteit
toont hoeveel is geabsorbeerd door de materie en zegt ons iets zegt over de kwaliteit en de kwantiteit van de moleculen
in het staal.
4.3 Molecuulspectra – atoomspectra
Een interactie tussen materie en straling vindt plaats in een 2-staps proces, waarbij het molecuul in een aangeslagen of
geëxciteerde toestand terechtkomt. Dit gebeurt vaak d.m.v. hoge energetische straling. Het aangeslagen molecuul wil
terugkeren naar een stabielere fase en kan dit op verschillende manieren doen:
• Terugzenden van licht : emissie van licht, fluorescentie of fosforescentie
• Wanneer het over mindere hoeveelheden van energie gaat zal het via relaxatie processen. (vnl. warmte en dus
niet zichtbaar wel met IR-meting)
• Een fotochemische reactie waarbij de molecule een transformatie ondergaat en een andere molecule wordt.
Er zijn 3 basisprocessen waarbij een molecule straling kan absorberen :
• Rotatie rond de verschillende assen (lage energie)
o rotatie-energietransities
• Trillingen van atomen of atoomgroepen in de molecuul (relatief t.o.v. elkaar)
o (hogere energie) – vibratie-energietransities
• Transfer van elektronen in een molecule naar meer energierijke orbitalen (hoogste energie)
o elektronentransities
Telkens wordt de molecule op een hoger inwendig energieniveau gebracht (de energietoename = energie van de
hoeveelheid geabsorbeerde straling)
5
,4.4 Indeling spectroscopische analysemethoden
Je kunt spectroscopische analysemethoden indelen o.b.v. verschillende factoren, zoals:
• De golflengte van de gebruikte straling, zoals UV-licht, zichtbaar licht, IR-licht en X-stralen.
• De interactie tussen materie en stralingsenergie :
o Absorptie – waar de hoeveelheid geabsorbeerde straling wordt gemeten
o Emissie – waar de hoeveelheid stralingsenergie van een geëxciteerd staal wordt gemeten
• De aard van het bestraalde stelsel, ofwel atomair of moleculair.
• Het proces dat wordt gebruikt, bijvoorbeeld in vaste fase, oplossing, gasfase, in vlammen of m.b.v. elektrische
bogen.
5 Absorptiespectrofotometrie
Bij absorptiespectrofotometrie speelt de wet van Bouguer-Lambert-Beer een belangrijke rol.
Door licht van een bepaalde intensiteit door een oplossing te laten stralen en vervolgens de intensiteit van het
doorgelaten licht te meten m.b.v. een kuvet, kan de mate van lichtabsorptie bepaald worden. Het is van belang dat
zowel de oplossing als de kuvet zelf geen licht absorbeert of reflecteert.
De wet van Bouguer-Lambert-Beer beschrijft het verband tussen de mate van lichtabsorptie en de dikte van de
absorberende laag. Uit onderzoek bleek dat bij steeds dikkere kuvetten de transmissie van licht afneemt (niet lineair).
Dit verband is exponentieel en omgekeerd evenredig met de concentratie van de oplossing.
De wet van Bouguer-Lambert-Beer combineert de coëfficiënt (a), de dikte van de kuvet (b) en de concentratie van de
oplossing (c). De absorbantie (A) is afhankelijk van de concentratie en kan gebruikt worden om een verband te leggen
tussen de concentratie en de mate van absorptie.
6
,5.1 Bouwstenen van een fotometer
Een goede lichtbron heeft een hoge lichtintensiteit (vs. klein stralingsoppervlak) en een breed spectraal bereik (grote
stralingswaaier), zonder scherpe emissielijnen (wanneer bepaalde atomen in de lichtbron zitten) en met een stabiele
uitgangsintensiteit en lange levensduur. Men kan kiezen tussen de wolfraam (tungsten), lamp (zichtbaar licht) en
deuteriumlamp (UV).
De functie van een monochromator is om specifieke golflengtes te selecteren uit het licht van de bron. Dit kan worden
bereikt door middel van kleurfilters
• De beste keuze is een prisma van glas of kwarts omdat dit zelf geen licht absorbeert. Lenzen zijn nodig om het
licht te focussen.
• Een ander type is het rooster, dat diffractieverschijnselen gebruikt om het licht in verschillende golflengtes te
splitsen. Het rooster is een gepolijst metaal oppervlak met een groot aantal fijne krassen. Dit is handig voor
speciale behoeften, maar voor de meeste toepassingen is een prisma geschikter.
Materiaalhouders zoals kuvettenhuizen zijn vaak gemaakt van doorzichtig materiaal zoals kwarts of glas (i.p.v. plastic,
dat goedkoper is). Ze zijn wel gevoelig voor krassen die het licht verstoren en leiden tot meetfouten. Het is het beste
om metingen uit te voeren van een lage naar hoge concentratie om te voorkomen dat restanten van hoge concentraties
de volgende meting beïnvloeden.
Detectoren zetten het lichtsignaal om in een elektrisch signaal en hebben een gevoeligheid die afhankelijk is van de
golflengte. De meeste detectoren kunnen een brede range aan golflengtes detecteren, van UV tot zichtbaar licht. De
meest gebruikte detectoren zijn de fotomultiplier en de diode array detector.
• Bij een fotomultiplier wordt het doorgelaten licht tegen de detector (kathode) gestuurd, waarbij elk foton een
foto-elektron aanmaakt. Deze worden versterkt door botsingen met dynodes, waardoor de anode een duidelijk
signaal heeft om te meten.
• Bij de diode array detector wordt het licht door een rooster gestuurd, waarna de detector het absorptieniveau
voor een reeks golflengtes kan meten.
7
,De spectrometer dient regelmatig gecontroleerd te worden. Dit omvat:
• Het ijken van de golflengteschaal met ijkfilters, ongeveer elke 6 maanden.
• Het controleren van absorptiewaarden met ijkfilters of oplossingen met bekende absorptie.
• Het minimaliseren van strooilicht door de cuvet te vullen met een oplossing die al het licht absorbeert. Hierbij
geldt: hoe minder strooilicht, hoe groter het lineair bereik.
• Het uitvoeren van een controle op de wet van Bouguer-Lambert-Beer.
5.2 UV–VIS spectrofotometrie
Het absorptiespectrum toont hoe de absorptie (transmissie) verandert met de golflengte van het opgestraalde licht.
Het wordt gebruikt om op een kwalitatieve manier een molecuul « tentatief » te identificeren. Het is een relatief zwakke
techniek die ons weinig vertelt over de kwalitatieve aspecten. De karakteristieke curve die we krijgen is onafhankelijk
van de concentratie. De absorptie kan gekwantificeerd worden door de meting van de transmissie op een bepaalde
golflengte.
Voor het meten van de mate van transmissie (en dus indirect de absorptie) wordt een cuvet (glas, plastic of kwarts met
parallelle wanden) met de vloeistof gevuld. Door de cuvet wordt er monochromatisch licht gestuurd. Achter de cuvet
wordt de intensiteit van het doorgelaten licht gemeten.
8
, Het doorgelaten licht is zwakker (lagere intensiteit) dan het opvallende (“incidente”) licht door …
• reflectie aan de respectievelijke grensvlakken tussen lucht-glas, glas-vloeistof, vloeistof-glas en glas-lucht
• absorptie door de glaswanden,
• lichtverstrooiing in de vloeistof (vb. door stofdeeltjes, maar is voor heldere oplossingen te verwaarlozen),
• absorptie door het oplosmiddel (dit is voor kleurloze oplossingen te verwaarlozen),
• absorptie door de gekleurde stof in de oplossing.
Bij het kwalitatieve aspect (zie linker grafiek) wordt de structuur bepaald door het gehele absorptiespectrum te
analyseren en de absorptie van elke golflengte te meten. Het absorptiespectrum heeft onvoldoende resolutie om veel
structurele informatie te geven en wordt daarom gebruikt in combinatie met andere technieken. Het uitzicht van het
absorptiespectrum wordt beïnvloed door de aard van het oplosmiddel en de pH.
Bij het kwantitatieve aspect voor UV (zie linker grafiek) wordt de concentratie bepaald door het doseren van
bijvoorbeeld eiwitten en nucleïnezuren of NAD-afhankelijke enzymen te bestuderen.
Bij het kwantitatieve aspect voor VIS (= zichtbaar licht) (zie linker grafiek) wordt de concentratie bepaald door enzymen
te gebruiken of organische en anorganische stoffen te meten na een kleurreactie (vb. Cr 2O7-2 naar Cr3+).
Verschillende factoren hebben invloed op de absorptie (= optische densiteit), waaronder de pH (ionisatie of
chromoforen), de redox status, de polariteit en de solventeffecten.
5.3 Bichromatische analyse
Een bichromatische analyse is een kwantitatieve analyse van
mengsels, meestal binaire. Hierbij dienen de
absorptiecurves elkaar te overlappen.
Deze analyse wordt gebruikt om de zuurstofverzadiging van
hemoglobine naar oxyhemoglobine te meten en om de
configuratie van tetracyclines te bepalen.
9
