Samenvatting
Samenvatting les 4/6 van Biotechnologie
Samenvatting van les 4 van biotechnologie van de slides met eigen notities.
[Meer zien]Voorbeeld 3 van de 22 pagina's
Voorbeeld 3 van de 22 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodiesRecap: van DNA naar construct
,Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies
- Kennis van de finale applicatie leidt de tussenliggende stappen
- Meerder manieren om EW te klonen, subklonen, tot expressie brengen en zuiveren
o Zijn allemaal correct maar sommigen meer kans om te werken of zijn sneller.
- Kloneringskuzes
o Bron van DNA
o Verschillende methodologieën voor DNA-assemblage
- Expressiekeuzes
o Keuze van expressiesysteem (en subkloneringsstrategie)
o Keuze van zuiveringstags (purification tags)
o Keuze van linkers
scFV (IgG)
= single chain variable fragment
- Fv: 3 CDR-lussen waar Ab bindingspotentieel heeft, specifiek voor een bepaald doelwit.
- Voor toepassing: maak scAb MAAR begin met DNA = ½ van Fv gecodeerd in ene gen en
andere ½ gecodeerd in ander gen DUS assembleer 2 genen.
o Samen = klein eiwit: lage glycosylering + niet giftig.
Gastheer kan E. Coli zijn
Expressie kan IPTG systeem zijn
- Hoge zuiverheid nodig
Linkers en tags
- Variëren van een paar AZ tot hele fusiedomeinen
- Tags invloed op: zuivering, lokalisatie, labeling en vouwen.
o Intein tag = sequenties die zichzelf uit een EW kunnen splitsen.
o Impact tag een gemanipuleerd inteïne, gefuseerd met CBD = chitine-binden domein.
CBD zorgt dat getagde EW efficiënt in kolom vastligt + inteïne actief
selectieve elutie van sterk gezuiverd tot expressie gebracht EW.
- Linker = elke EW-sequentie die 2 PoI’s koppelt, die samen TxL ondergaan.
Typische planning
- Plasmide bevat al regulatie van TxN.
- pET met His-tag: snelle zuivering maar niet selectief
o Alternatieve zuiveringsstrategie nodig
- EW-linkers: scheiden individuele componenten van PoI en tussen PoI en zuiveringstag.
- Nu componenten zijn bepaald, kan montage gepland worden, incl. reviseren componenten.
VH = variable heavy VL = variable light: top van IgG, samen vormen ze IgG-bindingsplaats, afkomstig
van een single Ab.
Gebruik intein purificatie tag want we willen hoge zuiverheid, beter dan His-tag.
Je weet hoe je je PoI wil hebben: je kan ook enkele componenten herzien, hier is hoeveelheid
engineering die ik in pET28 moet doen, om alle deze van constructie op te nemen, aanzienlijk kies
om met andere vector te werken (construct in 1w): reduceert probleem = 3 fragmenten ipv 5.
Captaliseer SapI-fragment of SapI endonuclease plaats voor klonering.
, Biotechnologie Les 4: Protein tags and antibodies
Kloon de laatste overhang, vanwege flexibiliteit bij samenstellen van fragment, kies ik ook type IIS.
Voorkant kies ik voor een stom uiteinde.
Codeer de linker als primeroverhang: assembleer niet meerdere fragmenten MAAR 2x PCR om
fragment te amplificeren en type IIS samen samen met blunt end kan ik klonen.
GSSGS-EW toevoegen tussen PoI en TEV-tag
- Glycine en Serine = kleine sterke polaire AZ flexibele tag genereren
kans dat TEV-tag beschikbaar is voor proteasen stijgt.
Overhang kiezen voor type IIS-klonen om niets over te laten tussen VL en
purificatie tag.
- SapI plaats in pTX1 plasmide strategisch geplaatst:
o Overhang = sequentie die codeert voor Cysteïne dat later door Inteïn geplitst wordt.
- Als je die overhangende sequentie gebruikt tot expressie gebrachte EW bij Cysteïne
afgesplitst geen enkel toegevoegd AZ blijft achter (IIS = zonder scar).
Linker tussen VL en purificatie tag om purificatie tag te verwijderen
- PT = intein-CBD: activatie inteïne splitsing en afgifte van EW = geen linker nodig.
- PT = His-tag
o Vaak zonder linker
o Indien wel linker: varieert van 1 AZ tot meer gevestigde linker en variaties daarvan.
G4S (variatie = GSSGS)
Biotherapeutische engineering
Reikwijdte
- Punt mutaties, inserties en deleties
- Chemische aanhechting van aanvullende chemische functionaliteit
- Onnatuurlijke AZ
- Tags (zuivering)
- Domein wisselingen (chimere Ab)
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper VDSA. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €7,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 82191 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen