Samenvatting
Samenvatting les 3/6 van Biotechnologie
Samenvatting les 3 van biotechnologie obv notities van slides.
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 15 pagina's
Voorbeeld 2 van de 15 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
Biotechnologie Les 3: From gene to protein IIEerste stappen in discovery
Van gekend target naar therapeutisch proteïne
- Ontdekking gebaseerd op
o Assays om gezochte functie te meten
o Scheidingsmethoden: functies isoleren
o Methoden voor bepalen van identiteit van betreffende molecuul
Geïsoleerd producerend weefsel (insulinoma) van bekend potentieel therapeutisch EW (insuline)
Ga uit van in insulinoma = kankercellijn dat veel insuline produceert
- Aanname: hoog EW-niveau = hoog mRNA-niveau
o NODI voor 1e stap in protocol = RNA isoleren: guanidinium denatureert alle EW of AA
en organische extractie in een CD5 conditie terugwinning van alle RNA’s (r,t,m).
Totaal RNA extract: mRNA kleine fractie 0,3% mRNA codeert voor insuline
Extractie mRNA (RT met een hoge kwaliteit templaat) manier om insuline-mRNA eruit te halen
- Eukaryote cel: polyA-label essentieel voor terugwinnen van mRNA uit cellen.
TxL geïsoleerd mRNA: aantonen dat er insuline geproduceerd werd, gedetecteerd met Ab.
RT met polyT primer, bindt polyA staart in mRNA converteert RNA info terug in DNA.
- Geen introns in volwassen mRNA
- Labeling van terminale transferasen (TdT) om compatibele overhangen te creëren
RT verwarmen: RT denatureren + TdT
Geen SMART-primer: fixeren cellulaire polymerasen 2 e streng (cDNA gemaakt door RT)
Origineel insuline klonen
Klonen van mRNA in plasmide
- Plasmide onbekend plasmide = klassiek moleculair biologisch plasmide
- Gedigereerd met endonuclease = creëert ingangspunt
- TdT met dGTP als substraat
- Tdt geen templaat nodig, iav dGTP creëert poly-G overhang aan 3’end geen
basenparing mogelijk plasmide kan niet ligeren.
plasmide pBR3222 geknipt met PstI,
gezuiverd en geïncubeerd met Tdt + dGTP
plasmide: polyG overhangen, niet re-ligeren
Polymerase = TdT geen templaat: product afh van elke toegevoegd nucleotiden: dGTP dus enkel G.
, Biotechnologie Les 3: From gene to protein II
poly-dT pirmer bindt polyA in mRNA + RT
gesynthetiseerd cDNA behandeld met TdT + dCTP
cDNA = 50% RNA + 50% DNA
polyG en polyC overhangen zijn compatibel en kunnen ligeren
levensvatbaar plasmide gecreëerd.
Na transformatie: kolonies isoleren (degene waarvan sequentie bepaald of
gescreend werd dmv plotten om zeker te zijn dat verwachte sequentie voor
insuline EW aanwezig was)
Insuline isolatie vandaag de dag
Ingangspunt nog steeds RNA, maar snellere manieren.
A) Poly T-primer bindt polyA mRNA geeft priming-plaats die RT kan verlengen.
B) + overhangen (onbekende sequentie, zelf kizen) voor RT-primer
o RT vindt plaats
o DNA klaar + C-overhangen = verder dan DNA, maar indien + SMART-oligo met
korte G-overhang bindt het ontluikende C’s RT blijft synthetiseren tot einde oligo.
onbekende sequentie in 5’ prime van RT + bekende sequentie in SMART-oligo
maakt PCR mogelijk
C) Versnellen: biotine gelabelde primer
o Post-PCR: producten vangen mbv streptavidine-gecoate korrels + proces
stroomafwaarts versnellen.
o Kies overhangs (rood), kies primer sites (blauw)
D) Kan gesequenced, gekloond en gesynthetiseerd worden.
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper VDSA. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €7,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 57413 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen