Leer je voor het vak 'Methoden in het Biomedische Onderzoek 3' aan de KU Leuven en heb je behoefte aan een handige samenvatting? Zoek niet verder! Ik bied een uitgebreide, maar toch beknopte samenvatting van alle belangrijke onderwerpen, concepten en methoden die je moet beheersen om succesvol te z...
▪ De novo genoom sequentie bepaling
-- Adhv. Puzzelen met overlap
▪ Resequencing
--Tov. Referentie genoom mappen
--Mutaties vinden
--Pharmacogenetica (personalized medcine)
▪ Sequentiebepaling als teller
--Hoeveel keer iemand een bepaald DNA of RNA heeft
1ste generatie sequentie bepalingen
• Maxam en Gilbert
~Chemische klievingsmethode
+ -
Geen Niet specifiek
Korte fragmenten
• Sanger sequencing
▪ Dideoxy-ketens
▪ Polymerase + primers + 4 dNTPs + ddNTPs (met fluorescent label)
▪ Elektroferogram (van capillaire elektroforese)
▪ 1-30 basen niet afleesbaar
▪ Phred score per base (>30) = kwaliteit score
▪ Mutatiedetectie →2 verschillende basen want 2 verschillende allelen
, Voorbeelden 1st generation sequencing (Sanger)
1. Human genome project (YAC, BAC, hierarchical shotgunning, referentiegenoom)
2. Celera = eerste individuele genoom
3. Automatisering van sequencing
4. Meer delen van data experimenten
5. Evolutie bestuderen
6. Personalized medcine -> farmacogenomics
7. Ethische commissies
2de generatie sequentie bepalingen
~Short-read next-generation sequencing in grote hoeveelheden
→ streven naar 1000-dollar genome
+ -
Snelheid Korte read lengte (korter dan Sanger)
Kost Veel fouten
Weinig input nodig Niet 100 maar 99,99% accuraat
1. Inleiding, hoe werkt het sequencen
STAP1: Maken library: WGS, Mate pair library, WES
1. Kwaliteit controleren van DNA
-Hoeveelheid en concentratie (spectrometry)
-Zuiverheid (spectrometry A260/280)
-integriteit -> is het nog in 1 deel
→ elektroforese en uitsnijden
→ selecteren met magnetic beads
2. Fragmentatie
-sonicicatie, DNase
- OF ‘Tagmentatie’ (fragmenteren en adaptors
aanhangen in 1 stap adhv. Transposases)
3. End- repair
-Blunt maken door T4 polymerase
-5’ fosforyleren
-3’ A aanhangen adhv Taq polymerase
4. Adaptors bevestigen
-barcode
-PCR primers bevestiging
-ligatie met andere fragmenten
,STAP 2: in vitro amplificatie: miljoenen fragmenten maken
1. Emulsie PCR
2. Solid phase bridge amplification
3. Solid phase template walking
4. Rolling circle amplification
,STAP 3: Sequencen van clusters
1. Sequencing by synthesis met reversible chain terminators ILLUMINA
2. Sequencing by synthesis met single nucleotide toevoeging
-Pyrosequencing 454 ROCHE
-Ion-semiconductor sequencing IONTORRENT
-Sequencing by ligation SOLID
STAP 4: data analyse
2. De verschillende 2nd generation platformen
• Roche 454
+ -
Lange reads mogelijk Fouten bij repetities
Niet meer competitief
,Voorbeelden 454 Roche
➔ Watson’s genoom werd gesequenced
➔ Genoom van neanderthaler werd gesequenced
1. DNA library
1.Fragmenteren
2. size selectie op gel
3. gel extractie
4. adaptors toevoegen met
T4 DNA-polymerase
➔ B adapter is ge-
Biothynyleerd.
2. Emulsie PCR
3. Pyrosequencing
4. Data-analyse base calling
→adhv. Intensiteiten van signaal base toekennen →chromatogram waarde
+ fragment allignment and assembly
, • Illumina
+ -
Lage kost Korte reads
Hoge troughput
Hoge accuraatheid
Voorbeelden Illumina
➔ Van elk mensen ras wordt het genoom bepaald
➔ De route van emigratie uit Afrika bestuderen
➔ Kanker genotyperen
➔ Gepersonaliseerde geneeskunde
➔ Mammoeten genoom sequencing
1. Aanmaak DNA library
Adapters met volgende functies:
-binden en vorming van clusters op flow cel
-primer bindt sites
-sample identifiers ‘index sequentie’
2. Cluster amplificatie
3. Sequencing by synthesis met reversible chain terminators
-aangepaste polymerases nodig
-ddNTP plus fluorescent label
-sequentie aflezen in beide richitngen
4. Data-analyse
-base-calling
• ABI-SOLiD
+ -
Geen repetitie problemen Korte reads
Hoge accuraatheid Traag proces
,Voorbeelden ABI-SOLiD
➔ /
1. Library
2. Amplificatie
3. Sequencing by ligation
-interpreteren
van 4 kleuren
4. Data-analyse
Known
Distance
Rea Rea
d1 d2
Repetitive Unique
DNA DNA
Paired read maps
uniquely
Single read
maps to
, • Ion TORRENT
+ -
1uur Repitief moeilijk
Gewone nucleotiden Korte reads
Goedkoop
Real time
Voorbeelden Ion -Torrent
➔ Cancer
➔ Inhereted diseases
1. Library
De basic procedure (zie 4 stappen)
2. Amplificatie
Emulsie PCR
3. Ionsemiconductor sequencing
-Inbouw dNTP
-Er komt H+ vrij
-Stroomverandering
meten
-Meten van pieken
(repitief is dubbele piek)
4. Data calling
Rekening houden met pieken en dubbele pieken
2. Platformen voor 3th generation sequencing
• Helicos tSMS
/
• Pacific BioSciences
+ -
Lange seq /
Geen bias
Hoge accuraatheid >99,99%
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper kenjidemesure. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,49. Je zit daarna nergens aan vast.
