Samenvatting

Samenvatting moleculaire biologie periode 3+4 (3ML/FB)

0 keer verkocht

Vak
Moleculaire Biologie

Instelling
Karel De Grote-Hogeschool (KdG)

Samenvatting van moleculaire biologie deel 2 (periode 3+4). Samenvatting van alle hoofdstukken met afbeeldingen en extra notities van tijdens de lessen

[Meer zien]

Voorbeeld 3 van de 24 pagina's

Bekijk voorbeeld

Geupload op 26 juni 2023
Aantal pagina's 24
Geschreven in 2022/2023
Type Samenvatting

Volgen

Dorien2022 Lid sinds 2 jaar 21 documenten verkocht

€12,49

In winkelwagen

Opslaan

100% tevredenheidsgarantie
Direct beschikbaar na je betaling
Lees online óf als PDF
Geen vaste maandelijkse kosten

Deel 2: Moleculaire diagnostiek
1 Inleiding in de moleculaire diagnostiek
• Vaak gebruikt in het kader van erfelijke ziekten
• Voordelen bij het gebruiken van DNA:
o Stabiliteit
o Geen maatregelen om degradatie te voorkomen nodig
o Genomisch DNA is in elke normale cel identiek binnen een individu (staalname is niet afhankelijk van
de plaats van de pathologie)

2 Nucleïnezuren extraheren
Nucleïnezuren kunnen uit verschillende celtypes en weefsels geïsoleerd worden. Vaak afkomstig van perifeer bloed:
WBC / celvrij DNA

Afhankelijk van het type en de kwaliteit zal de hoeveelheid / kwaliteit / zuiverheid verschillen

2.1 Uitgangsmaterialen voor de isolatie van nucleïnezuren
• DNA
o Stabiel door dubbele helix structuur
o DNA kan uit zeer veel en verschillende materialen geëxtraheerd worden
• RNA
o Minder stabiel
o In oude stalen is RNA vaak al gedegradeerd
o Alle stappen voor en na de extractie moeten uitgevoerd worden met RNAse-vrij materiaal

• Kwaliteit van het extract:
o Afhankelijk van de leeftijd van het staal (in oude fossielen is DNA vaak afgebroken)
o In FFPE weefsel is door de fixatie het DNA ook vaak minder goed bereikbaar
▪ Fixatie beschermt weefsels tegen afbraak maar heeft een negatief effect op de kwaliteit van
de aanwezige nucleïnezuren
o De kwaliteit van het uitgangsmateriaal + de extractiemethode bepaalt de kwaliteit van het extract
▪ Voor bepaalde toepassing volstaat niet-gezuiverd DNA zoals PCR-amplificatie van kleine DNA-
fragmenten
▪ Voor lange fragmenten is zuiverder DNA nodig zodat een betere amplificatie kan worden
bekomen

2.2 Isolatiemethoden voor DNA en RNA
Bij opzuivering is het belangrijk dat:

• Vrij van nucleasen
• Geen verontreiniging

1

, • Voldoende DNA/RNA aanwezig is

Workflow binnen het labo:

• Homogeniseren van cellen / weefsel in
lysisbuffer
• Nucleïnezuren worden gescheiden van
vetten / eiwitten / koolhydraten
• DNA-isloatie met fenol / chloroform (oude
methode, tegenwoordig met behulp van een
kolom of magnetische beads)

2.2.1 Fenol / Chloroform
• De isolatiemethode start met het toevoegen van een lysisbuffer waardoor het celmembraan zal oplossen en
de celinhoud vrijkomt.
• De buffer bevat:
o Natrium- of TRIS zouten met EDTA als buffer
o Detergent om het membraan op te lossen
o Proteasen (lysozymen en proteïnekinase K) om de eiwitten en nucleasen te hydrolyseren
o Nuclease-remmers om te voorkomen dat de nucleasen hydrolyseren

OPM: andere protocollen gebruiken chaotroop zout (bv guanidine thiocyanaat of SDS) die cellen lyseren en tegelijk
eiwitten denatureert

• Chaotrope stoffen verstoren en denatureren de structuur van macromoleculen
• Verstoren van intra- en intermoleculaire niet-covalente bindingen zoals waterstofbruggen
• Verstoringen zorgen ervoor dat de 3D structuur van eiwitten verandert waardoor ze denatureren
• Door andere verstoringen valt de lipidendubbellaag van de membranen uit elkaar

Aan het cellysaat wordt een hoeveelheid organisch oplosmiddel toegevoegd

• Bij DNA: buffer-verzadigde fenol
• Bij RNA: water-verzadigd fenol

Na centrifugatie:

• Organische oplosmiddelen + vetten bevinden zich onderaan
• Eiwitten hebben een tweedelig karakter (polair of apolair afhankelijk van de restgroep) bevinden zich in de
interfase
• Nucleïnezuren + koolhydraten bevinden zich in de waterfase (bovenaan)
o Waterfase wordt overgebracht naar een ander epje
• DNA precipiteren door ethanol (met een zout, vaak natriumacetaat)
o Ipv ethanol kan ook isopropanol gebruikt worden
• Opnieuw centrifugeren waardoor de pellet onderaan DNA precipitaten bevat
• DNA opnieuw oplossen in buffer met neutrale pH en lage concentratie EDTA
o OPM: opnieuw ontdooien en invriezen van DNA zorgt voor breuken in de dubbelstreng
• De pellet kan ook RNA bevatten, dit kan verwijderd worden door eventueel RNAse-behandeling toe te
voegen

2

, 2.2.2 Chelex
Chelex = kunsthars bolletjes van een stureen
copolymeer met iminoacetaat ionen

• Ionen zijn negatief geladen
• Alkalisch midden (pH 10-11)
• Binden sterk aan Ca2+ en Mg2+

Door hitte incubatie lyseren cel- en
kernmembranen en denatureren eiwitten

De denaturatie in combinatie met het wegvangen van tweewaardige kationen zorgt ervoor dat nucelasen effectief
geïnactiveerd kunnen worden

Na centrifugatie bevindt het DNA zich in het supernatans, in de pellet bevinden zich de celresten en gedenatureerde
eiwitten

OPM: chelex gebruikt geen EDTA wat een voordeel is omdat het anders de PCR reactie zou kunnen inhiberen

2.2.3 Silica-kolom
De kolom bevat een sillica-membraan: sillica is in een waterig milieu negatief geladen waardoor de waterstofatomen
van een watermolecuul door de sillica worden aangetrokken

1e stap = cellysis met een hoge concentratie aan chaotroop zout

De zouten zullen in een waterig milieu een zoutbrug vormen tussen
de silica en het negatief geladen nucleïnezuur

De kolom wordt gewassen met een hoge zoutconcentratie en ethanol
om het DNA verder te zuiveren (+ ethanol zorgt voor een sterkere
binding tussen het DNA en de kolom)

Hierna worden de nucleïnezuren geëlueerd met nuclease-vrij water of een buffer
met een lage zoutconcentratie

Het zout wordt weggespoeld waardoor de kolom zeen negatieve lading krijgt en
de nucleïnezuren zal afstoten

3

Dit zijn jouw voordelen als je samenvattingen koopt bij Stuvia:

Bewezen kwaliteit door reviews

Studenten hebben al meer dan 850.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet jij zeker dat je de beste keuze maakt!

In een paar klikken geregeld

Geen gedoe — betaal gewoon eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard en je bent klaar. Geen abonnement nodig.

Focus op de essentie

Studenten maken samenvattingen voor studenten. Dat betekent: actuele inhoud waar jij écht wat aan hebt. Geen overbodige details!

Veelgestelde vragen

Wat krijg ik als ik dit document koop?

Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.

Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?

Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.

Van wie koop ik deze samenvatting?

Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper Dorien2022. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.

Zit ik meteen vast aan een abonnement?

Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €12,49. Je zit daarna nergens aan vast.

Is Stuvia te vertrouwen?

4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)

Afgelopen 30 dagen zijn er 66184 samenvattingen verkocht

Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen

Start met verkopen

Samenvatting

Samenvatting moleculaire biologie periode 3+4 (3ML/FB)

Document informatie

Onderwerpen

Geschreven voor

Verkoper

Ontvangen beoordelingen

Voorbeeld van de inhoud