Samenvatting
Samenvatting materials and methods to analyse your epigenome
- Vak
- Epigenetica
- Instelling
- Universiteit Antwerpen (UA)
samenvatting gebaseerd op de powerpoints en eigen notities
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 12 pagina's
Voorbeeld 2 van de 12 pagina's
In winkelwagenVoorbeeld van de inhoud
Materials and methods toanalyze your epigenome
Histone modifications
Western blot/ELISA
Antilichamen gemaakt specifiek tegen modificaties van histon aminozuren
o Slechts één modificatie tegelijk bestuderen mogelijk
→ verschillende patiëntenstalen of cellijnen onderzoeken met deze methode wordt
zeer duur, gezien één antilichaam snel €500 zou kosten
Histonen isoleren en antilichamen met fluorescente tag toevoegen
o Met toenemende hoeveelheid van bepaalde modificatie fluorescentie meten
→ simpelste methode om te weten of histon gemodificeerd is
o Probleem: verschillende labo’s gebruiken verschillende commerciële bronnen van
antilichamen
Bv: één commerciële bron van antilichamen herkende enkel fosforylatie van
S10 indien K9 tegelijk ook geacetyleerd was
Soms kan fosfo-antilichaam niet herkent worden als er een
acetylgroep gebonden zijn op K9 = epitoop-occlusie
K9 kan ook gemethyleerd worden naast acetylatie
→ tegenstrijdige resultaten kunnen verkregen worden
Proteomics
Eiwit verknippen met protease en dan alle peptides scheiden op basis van verschil in massa
o Extractie van histonen bij een heel zure pH (HCl of H 2SO4)
→ enkel histonen gaan in oplossing, andere structuren gaan kapot
Via proteases histonen verknippen in peptides
o Peptides kennen een massa, maar als er acetylgroep of methylgroep op zit zal er een
verschuiving in massa optreden
Alle mogelijke combinaties per peptide geeft 64 mogelijke
massaverschuivingen voor een peptide met 3 lysines
Een aantal combinaties geven dezelfde massaverschuivingen
→ Trainen van computers om deze verschuivingen te analyseren
Patroon van peptide zal uiteindelijk wel verkregen worden, maar de
rekentijd om de modificaties te achterhalen wordt astronomisch
groot
Staal van histonen in proteoommachine steken en zoeken naar clusters
o Massaverschuivingen zoeken en onderzoeken waar pieken zich bevinden
→ zoeken van patronen
Patronen kunnen mogelijks wijzen op bepaalde zaken
Gezien volledige dataset lange rekentijd zou innemen, wordt de dataset vereenvoudigd tot
50 meest voorkomende clusters → hierop meer gedetailleerde analyse uitvoeren
1
, Immunofluorescentie
Onderzoeken of specifieke histonvarianten wel of niet aanwezig zijn
o Co-localisatie van bepaalde modificaties
Antilichaam gebasseerde methode, dus altijd gevaar voor epitoop-occlusie
o Bias mogelijk door de te weinig specificiteit van de antilichamen voor modificaties
o Ook rekening houden met de emissiespectra van fluoroforen
Spectra kunnen interfereren en extra bias geven
Als pieken te dicht bij elkaar zitten, maakt dit dat signalen niet meer
correct kunnen geïdentificeerd worden
Mass spect cytometry
In plaats van antilichamen te labelen met fluorescente kleurstoffen worden er metalen
gebonden met elk verschillende isotoopmassa
o Beads met unieke masse → niet langer kijken naar lichtsignaal, maar naar de
aan-/afwezigheid van bepaalde massas
50 antilichamen allen tegen verschillende histonmodificaties met allen ander metaal label
→ signaal van bepaalde massa is aan of afwezig indien modificaties aan of afwezig is
o Op deze manier kunnen tot 135 verschillende antilichamen tegelijk kwantificeren,
wat onmogelijk was met immunofluorescentie of flowcytometrie
Chromatine immunoprecipitatie
Cellen crosslinken aan DNA met formaldehyde → ChIP-base gevormd
o Base reageert met lysine en nadien met cytosine
→ lysine van histonen binden met cytosine van DNA
Sonicatie (ultrasone trillingen of enzymatisch) zal lengte reduceren
→ fragmentjes van DNA gevormd met allen bepaalde modificaties
o Antilichamen toevoegen tegen specifieke modificaties
Maar één per staal mogelijk
Antilichaam bindt op nucleosoom met bepaalde modificatie
Immunoprecipitatie: cefarose beads toevoegen aan mengsel met affiniteit voor antilichamen
→ beads kleven aan antilichamen → zware bead gevormd → chromatine DNA
geprecipiteerd
o Aan bodem epje zitten fragmenten gebonden aan beads
Om te weten welk stukje DNA gebonden is hebben we reverse crosslinking
nodig → staal opwarmen maakt dat histonen loskomen van DNA
→ isoleren van DNA → PCR uitvoeren
Enkele verschillen tegenover de proteoom analyse
o Bij proteoom: alle histonen uit de cel halen, zonder te weten aan welk DNA ze kleven
o Bij ChIP: door crosslinking geweten welke DNA fragmenten aanwezig zijn
Met PCR nadien zien of DNA in bound of unbound fractie zat van de beads
Ook mogelijk om in plaats van PCR of hybridisatie op het einde een next generation
sequencing uit te voeren op alle geprecipiteerde fragmenten → ChIP-QPCR
o Pieken zijn fragmenten die geacetyleerde histonen dragen
Van elke histonmodificatie geweten waar in het genoom deze aanwezig is
→ map maken van histonnmodificaties waarvan antilichamen gekend zijn
Probleem: heel veel cellen nodig voor chromatine precipitatie
→ botsen zo op limieten van sensitiviteit
2
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper lauraheyndrickx. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €3,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 56326 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen