Dit is een samenvatting van hoofdstuk 13 uit het vak methoden in het biomedisch onderzoek 1 - analyse va het DNA.
Gebaseerd op de lessen en slides, bevat figuren uit de powerpoint.
2. DNA extraheren
Algemeen principe
1. Lysis = afbreken van cellen zodat het DNA vrijkomt
→ lysaat = vloeistof met inhoud van gelyseerde cellen
2. Isoleren = DNA uit het lysaat halen of opzuiveren
→ RNA en eiwitten verwijderen
3. Oplossen = DNA in gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen, hierbij
concentreer je het DNA ook
Lyseren
- Vaak toevoegingen:
o Remmers van niet-gewenste moleculen: RNasen, proteasen,…
o EDTA = complexeert Mg2+ waardoor die wordt afgeschermd van DNase → DNase
inactief, anders wordt DNA afgebroken
- Lysis mbv detergent
o Meest gebruikte methode → snel, reproduceerbaar, geen specifieke apparatuur
o Bij celculturen toegepast
o Hydrofiele kop en hydrofobe kop
Verdund voorkomen: monomeer
Hoge concentratie in oplossing: micelle met hydrofiele koppen naar
buiten en hydrofobe staarten naar elkaar gericht
, o Milde detergent (CHAPS, triton, ...)
= behoud van celorganellen mogelijk + tragere lysis
o Harde detergent (SDS, …)
= ook organellen worden opengebroken + proteïnedenaturatie
o Principe van detergent
Lipiden monomeren nestelen zich in het lipiden dubbelmembraan
Buitenste membraan wordt langer als binnenste → membraan krijgt licht
kromming
Op een bepaald moment: te harde buiging en membraan knapt open →
gaten in membraan
Langs opening gaten worden er eerst halve micellen en uiteindelijk hele
micellen gevormd
- Mechanische methoden voor lysis
o Voor DNA is dit vaak te bruut, daarom dat men meestal detergenten prefereert
o Sonicator: hoge frequentiegolven maken ook het DNA kapot → vermijden als je
DNA wilt analyseren
- DNA uit bloed lyseren
o Anticoagulans = anti-bloedstolling → EDTA, want heparine inhibeert DNA reacties
o NH4Cl → lyseert cellen zonder kern (bv RBC → heemgroepen kunnen verdere
analyse inhiberen)
o Men wilt de WBC → met kern en dus DNA
→ verder gaan zoals bij de cellen
- DNA uit weefsels lyseren
o In kleine stukjes disseceren
o Met vloeibare stikstof → in mortier met pestel pletten tot een
poeder
, → verder gaan zoals bij cellen
- DNA uit cellen lyseren: met buffer
o SDS = detergent → afbreken membraan + eiwitten
o Enzymes: eiwitten en RNA afbreken
o EDTA: complexeert Mg → inhibitie DNase
DNA isoleren
- Organische solventen
o Scheiding DNA, RNA en eiwitten op basis van verschillende oplosbaarheid in
verschillende niet-mengbare vloeistoffen
o Voeg phenol-chloroform-isoamyl extractie toe + vortex (mengen)
Phenol → denatureert eiwitten + minder polair dan water waardoor DNA
hier niet zal in oplossen
Chloroform → verhoogt efficiëntie van eiwit denaturatie + denatureert
lipiden
Isoamyl → vermindert schuimvorming
o Centrifugeer
Pellet = organische fase met lipiden + interfase met proteïnen
Supernatans = waterige fase met DNA
o Breng waterige fase over in nieuwe eppendorf
→ nadeel van deze manier: restanten van organische solventen in DNA + stoffen zijn
corrosief en toxisch
- Geconcentreerd zout
o Principe
Voeg NaCl toe en centrifugeer → onttrekt sneller water van rond de
eiwitten dan rond DNA → eiwitten slaan neer en vormen pellet
Supernatans bevat DNA → overbrengen naar nieuwe eppendorf
o Voordeel: eenvoudig, goedkoop en goede opbrengst & zuiverheid
o Na salting out & na phenol-chloroform extractie → ethanol precipitatie
(neerslaan van DNA) voor verdere opzuivering en concentratie van DNA (zie
verder)
- Kolomchromatografie
o Principe
Bepaalde condities van zout en pH zorgen ervoor dat DNA aan matrix van
kolom bindt
Andere condities zorgen voor elutie = vrijzetten van DNA
o Drijvende krachten van beweging doorheen kolom
Centrifugatie
Zwaartekracht
Vacuüm
o Verschillende types
Silica kolom
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper laurebrants. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €3,99. Je zit daarna nergens aan vast.
