Dit is een samenvatting van hoofdstuk 12 uit het vak Methoden in het biomedisch onderzoek 1: Celbiologische methoden.
Gebaseerd op de slides en het hoorcollege, bevat figuren uit de powerpoint.
Hoofdstuk 12: celbiologische methoden
→ biologisch functioneren van cellen (ze doen aan allerhande processen) en deze processen kunnen
weergeven mbv specifieke methoden
1. Flow cytometrie
- Flow cytometrie: informatie over individuele cellen!!
o Bepalen welk % van de cellen een bepaalde merker bevat
- Vergelijkbaar met FACS (hfdst 3 en 8) maar ipv scheiding van cellen op het einde gaan ze
gewoon in de vuilbak
- Algemeen principe:
o Cellen analyseren adhv merkers die aangekleurd worden door fluorescent gelabelde
antilichamen
o Expressieprofiel van markers op cellen
Op celoppervlak
Intracellulair → plasmamembraan moet eerst toegankelijk gemaakt worden:
gaatjes in membraan gemaakt = permeabilisatie van membraan
o Gaan door buis en worden belicht door laser → op basis van licht dat wordt
teruggekaatst kan de detector een beeld geven van welke cellen er aanwezig zijn
- Je kan meerdere merkers tegelijk gebruiken!!
- Negatieve controle
= cellen worden niet gemerkt met fluorescente merker, maar doorlopen zelfde proces
→ achtergrondsignaal
→ nodig om grens tussen positief en negatief resultaat te trekken
- Resultaten worden weergegeven in
2. Celproliferatie
- BrdU test: celproliferatie meten
- Principe: BrdU = bromodeoxyuridine → thymidine analoog → tijdens S-fase ingebouwd ipv
Thymidine
- Werkwijze
o Cellen laten opgroeien
o BrdU toevoegen voor een 4-tal uur en verder laten groeien → BrdU wordt ingebouwd
in DNA tijdens S-fase
o Antilichaam Cy5 tegen BrdU toevoegen:
Cel permeabiliseren (membraan toegankelijk maken zodat Cy5 in kern
terecht kan komen)
Cy5 toevoegen
, o Merker meten → histogram
- Resultaat interpreteren:
o Blauwe lijn = negatieve controle
o Gele pieken = plekken waar cel prolifereert
2 pieken = 2 populaties
1e piek is onder blauwe controle = geen BrdU
aanwezig = niet actief aan het delen
2e piek = wel BrdU aanwezig = wel actief aan het
delen
3. Celleefbaarheid
- MTT test: aantal levende cellen bepalen
- Principe:
Levende, intacte cellen hebben levende, intacte mitochondriën; deze litochondriën bevatten
mitochondriaal dehydrogenase die geel MTT kunnen omzetten in paars formazan
→ paarse kleuring is evenredig met aantal levende cellen
- Werkwijze
o Cellen laten groeien in 96-well plaat
o Gele MTT oplossing toevoegen en enkele uren laten incuberen in celcultuurincubator
o Optische densiteit/ absorptie meten op multi-well plaatlezer (= spectrofotometer)
→ hoe paarser, hoe meer levende en intacte cellen
- LET OP: dit is een indirecte meting!! Je moet opletten als je andere producten gaat gebruiken
die ook effect gaan hebben op aanwezige enzymen/ mitochondriale activiteit
4. Celdood
- Tunel test: meten van apoptose (breuken in DNA = dood)
o Principe: bij cellen in apoptose is er fragmentatie van DNA, hierdoor kan men Br-
dUTP inbouwen adhv enzyme TdT (= Terminaal deoxynucleotidyl Transferase)
o Werkwijze
Weefselcoupe of celsuspensie (maken en) FIXEREN & permeabiliseren
TdT en Br-dUTP toevoegen
Antilichaam tegen Br-dUTP toevoegen → ingebouwd Br-dUTP detecteren
Detectie met fluorescentie of histochemische kleuring
Histochemie: kleuring → apoptotische cel wordt bruin gekleurd
- Propidium Iodide flow cytometrie: dode cellen tellen
o Principe: Propidium Iodide = PI kan enkel in dode cellen binnendringen → celkern:
binden aan DNA = intercaleren → geeft fluorescent signaal
o Werkwijze
Cellen incuberen met PI
Flow cytometrie
PI fluorescentie → meer fluorescent signaal = meer PI = dode cel
Forward Scatter (FSC) = “schaduw van de cel” → maat voor grootte
van de cel: levende cellen hebben grotere FSC dan dode cellen
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper laurebrants. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €3,99. Je zit daarna nergens aan vast.
