Samenvatting van hoofdstuk 11 uit het vak Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1. Dit hoofdstuk gaat over Elektroforese en Western Blot.
Samenvatting gemaakt aan de hand van de slides en de hoorcolleges.
Hoofdstuk 11: elektroforese en western blot
→ belang: technieken om (specifieke) biomoleculen van elkaar te scheiden
1) Introductie elektroforese
- Principe: scheiding van geladen deeltjes op basis van grootte doordat ze doorheen een gel
worden gestuurd onder invloed van elektrisch veld
o Elektrisch veld: laat geladen deeltjes bewegen
o Gel: 3D matrix die als een zeef werkt
- 2 gelsystemen:
o Agarose: polysacharide → scheiding van nucleïnezuren
Horizontale gel
Niet-toxisch
o Polyacrylamide: cross-linked polymeer van acrylamide → scheiding van eiwitten
Acrylamide + methyleenbisacrylamide (=cross linker) + katalysatoren (=
TEMED of ammonium persulfaat
Verticale cel + kleinere poriegrootte
Onbewerkte acrylamide = neurotoxisch
Denaturerende condities of natief
Denaturerend = 3D structuur van eiwit wordt afgebroken: je
analyseert de lineaire AZ-sequentie
Natief = biomoleculen hebben intacte structuur
2) Agarose gel elektroforese
- Scheiding van nucleïnezuren op een agarose gel
- Voorbereiden opstelling
o Gieten van agarose gel
Agarose poeder + buffer → opwarmen zodat agarose smelt
Buffer = TAE of TBE → tris-acetaat-EDTA of tris-boor-EDTA
EDTA = bindt divalente kationen (Ca2+, Mg2+) want bv Mg wordt
gebruikt door enzymen die DNA en RNA afbreken
→ door EDTA toe te voegen stabiliseer je DNA en RNA
Laten afkoelen in gelbakje met kam
o Staalvoorbereiding
Laadbuffer toevoegen aan je DNA/RNA staal
Kleurstoffen: zien hoe ver je staal migreert, maar bindt niet met DNA/RNA
zelf → broomfenolblauw of xyleencyanol
Glycerol toevoegen: staal zwaarder maken zodat het staal in de gel blijft en
niet naar boven drijft in het water dat boven de gel wordt toegevoegd
o Gel laten lopen
DNA stalen in “welletjes”
deponeren
, DNA ladder/ marker toevoegen = mengsel van DNA fragmenten met gekende
lengte → referentiewaarden
o Visualiseren via bindende kleurstoffen
Bij DNA/RNA binding geven bepaalde kleurstoffen een fluorescent signaal
onder UV of blauw licht
Ethidiumbromide (EtBr):
Signaal bij UV licht → ogen en huid beschermen + DNA beschadigt
Zeer gevoelig (1-5 ng (nanogram))
Toxisch en mutageen/ carcinogeen
SYBRsafe:
Blauw licht en UV licht
Zeer gevoelig (1-5 ng)
Minder mutageen, maar nog steeds toxisch
- Toepassingen:
o Lengte DNA fragment nakijken
o Scheiden van DNA fragmenten voor opzuiveren
DNA fragmenten liggen door elektroforese verder uit elkaar → isoleren van 1
fragment door dit uit de gel te snijden
DNA uit gelblokje isoleren/ zuiveren
o Nakijken integriteit RNA:
RNA → veel rRNA → coderen voor 2 subeenheden ribosomen dus gaan 2
grote signalen uitzenden
2 duidelijke ringen: RNA is intact
Signaal is uitgesmeerd: RNA is gedegradeerd = afgebroken door RNase
- Gelpercentage bepaalt de poriegrootte van gelmatrix !!
→ hoe lager percentage, hoe groter de poriën, hoe verder DNA fragmenten kunnen migreren
→ je moet dus een percentage kiezen dat compatibel is met de DNA fragmenten die je wilt
analyseren!!
3) Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE)
- SDS-PAGE → scheiding volgens massa/grootte
o SDS = sodium dodecyl sulfaat = anionisch detergent
o Principe: denaturerende werking
SDS toevoegen → bindt met aan aminozuren van eiwit → ontvouwt eiwit en
geeft een uniforme negatieve lading
2-mercaptoethanol → disulfidebruggen breken
Opwarmen tot 70°C → eiwit wordt beweeglijker en gaat makkelijke
ontvouwen (niet hoger als 70°C → samenklitten)
o Lineaire structuur met negatieve lading (proportioneel aan lengte & massa eiwit)
op/in de gel laden
o Negatieve pool aan kant van staal → elektrisch afstotend → migratie richting
positieve pool = elektrisch aantrekkend
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper laurebrants. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,89. Je zit daarna nergens aan vast.
