Samenvatting
Samenvatting methoden 2 RNA
- Instelling
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
methoden 2 - deel 3 RNA
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 13 pagina's
Voorbeeld 2 van de 13 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
2.3 RNAInleiding
DNA vs RNA
- Thymine (stabieler) vs uracil
- Deoxyribose: Geen 2’OH vs ribose: 2’OH
=> 2’OH vatbaar voor afbraak door RNAsen
DUS DNA stabieler dan RNA => makkelijk modificaties
- Ds vs ss
- RNA kan secundaire/tertiaire structuur hebben + korter dan DNA
(ddNTPs bij Sanger sequencing => ook geen 3’OH => geen ketenverlenging (fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten I mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor kwaliteitscontrole (zie verder) Coderend RNA
lncRNA = lang (>200 nt) I siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie) Niet coderend RNA
mRNA
DNA → pre-mRNA → mRNA (matuur) → polypeptide
Splicing = verwijderen intrionen
TXN splicing TLN
Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen + intrionen + polyAstaart
mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA => niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modificatie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
- Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
snel werk, inviezen (vloeib. N2),
RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
→ bij bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of
RNAlater (voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct,
buffer/water bewerken met RNAse inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer: Tris= amine)
, Bewaring RNA
In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar <DNA),
als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
- Niet altijd probleem
- Detectie via electroforese of RTmin controle
DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(l) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen DNAse
RNA extractie
! vgl met DNA extractie
1)Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => °lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh. startmateriaal en
doel)
- Toep. lyseren: In extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3), eiwitten (Hfdst 2.4)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen, proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden: HT1.3)
• Mechanische homogenisatie:
o Pletten in mortier met pestel (in vloeibare stikstof)
o Bead-gebaseerde homogenisator:
beads (= kralen) in buis met cellen + schudden => °homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer:
oplossing tussen glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA frag nodig)
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper paulinebal. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 67096 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen