Samenvatting
Samenvatting Methoden 2 - deel 4 eiwitten
- Instelling
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
Methoden 2 - deel 4 eiwitten
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 14 pagina's
Voorbeeld 2 van de 14 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
2.4 EiwittenIsoleren van eiwitten
Homogenisatie dmv homogenisatiebuffer + verdere opzuivering (vaak)
Startmateriaal (staal) → ruw eiwitlysaat
Opbouw homogenisatiebuffer
• pH buffer bv Tris (pHbuffer = 7,5 = pHcel) <> bij bv. lysosoomale eiwitten zuurdere pH
→ pH bepaald Q => oplosbaarheid en activiteit eiwit
• Zout bv. NaCl
=> geen denaturatie + goed oplossen
• Proteasen inhibitor => geen afbraak eiwit
=> ≠ proteasen => bindt AZ/metaal in de katalytische site => inhibitie katalyse
=> tablet: mengsel meerdere protease inhibitoren
!met/zonder EDTA (als activiteit doel-eiwit beinvloed door EDTA bv. DNAsen)
o PMSF, BZA, aprotinine => serine proteasen bv.trypsine, thrombine, kaklikreine
o EDTA => Metalloproteasen
o Leupeptine => Cysteine proteasen (/thiol)
o Pepstatine => Aspartaat proteasen bv.pepsine, renine, cathepsine
• Event. Fosfatase inhibitor => geen defosforylatie
=> vaak mengsel meerdere
o NaFloride, NaPyrofosfaat, B-glycerofosfaat => Ser-/threonine fosfatasen
o NaOthovanadaat => Tyrosine fosfatasen
• Event. Detergent bv. NP40, Trition-X100, CHAPS,SDS
=> oplossen celmembraan, bij eiwitten die niet oplossen in H2O-opl.
• Event. Reducerend stof bv. DTT, 2-mercapto-ethanol
=> bregen SS-bruggen
Verdere opzuivering eiwitten
Chromatografie of elektroforese
Aanmaken van eiwitten
Doel
- Eiwit functie/structuur bestuderen, antistoffen zoeken tegen eiwit
- Eiwitmedicijn: antillichaam (tegen bepaald eiwit)/hormoon/enzym
- In waspoeder (lipasen,..) en voeding (enzymen,…)
Chemische synthese in vitro
Werking: synthese van C → N-terminus
1) Koppeling harsparel+peptidelinker aan carboxyterminus AZ
→ beschermingsgroep op N-terminus en zijketens AZ => bindt niet
2) Verwijder bescherming N-terminus
3) Koppeling C-terminus nieuw AZ (met protectie) aan N-terminus vorige
4) Repetitie
5) N en zijketen deprotectie + afklieven eiwit van hars en linker
=> °eiwit
, Pos: de novo synthese artificiële eiwitten (AZ die niet in natuur voorkomen)
niet toxisch voor organisme + onafh. AZ-beschikbaarheid
Neg: duur, enkel kleine hoeveelheden
koppelingsefficiëntie per cyclus (1AZ) = 99% => enkel korte seq. (max. 50 AZ) 1%fout
→ oplossing: langer eiwit door koppelen 2 peptiden van 50AZ
↳neem N-protectie af van peptide1 en harsparel van peptide2 (vrije carboxy)
Toep: maken artificiële eiwitten, peptiden voor antistofproductie
Enzymatische synthese in vitro
In vitro translatie RNA in konijn reticulocyt lysaat (of terwekiem extract)
↳ gespecialiseerde TLN machinerie: ribosomen, AZ, E (+geen DNA)
Kan 1e in vitro TXN (DNA→RNA), daarna in vitro TLN (in 2 of 1 reacties)
Pos: snel, eenvoudig
Neg: kleine hoeveelheden
Toep: bepalen ORF (welke AUG van RNA is startcodon)
structurele en functionele studie (impact mutatie)
In vivo expressie systemen
!voor en nadelen organismes
Recombinante eiwitproductie:
1e recombinant DNA in plasmide kloneren => in organisme: TXN + TLN → recombinant eiwit
=> eiwit vrij door lyseren cellen/ secretie in medium
Gekozen organisme bepaalt expressie plasmide
Codon optimisatie:
Genetische code = gedegenereerd: synonieme codons => zelfde AZ
→ abundantie codon afh. organisme/celtype => keuze codon afh. #tRNAs voor codon aanwezig
Dus ∆DNA sequentie naar aanwezigheid tRNAs => ∆ snelheid TLN (<> gelijke eiwitsequentie)
→ Hogere eiwitexpressie als veel tRNAs voor dat codon aanwezig
Transiente eiwitproductie:
- Korte periode (dagen)
- dmv transfectie: geen integratie recombinant DNA in genoom organisme => DNA in cellen
verdunt
Stabiele eiwitproductie:
- Lange periode (maanden)
- dmv transductie: recombinantie DNA in genoom gastheer => blijft in dochtercellen aanwezig
Productie op laboratoriumschaal (1ml cryotube-1L fles) vs industriele schaal (opschalen tot max
1000L
↳ 1-10x106 cellen ↳ 300x109 cellen tank)
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper paulinebal. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 67096 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen