1
Scheiding en zuivering van biomoleculen
1. Algemene inleiding
Biochemische analyse
Biochemie is de studie van chemische processen in levende organismen → doel:
begrijpen van moleculaire werkingsmechanismen van de cel. Vb. structurele,
kinetische en thermodynamische eigenschappen, pathways voor synthese en
degradatie, … → hierbij zowel staalvoorbereiding, zuivering en isolatie van
biocomponenten uit het staal en identificatie en karakterisatie van de componenten.
Biochemisch experiment
Gebeurt volgens een cyclus: (1) vraagstelling en motivatie → wat en waarom, (2)
experimentele setup → hoe wordt het experiment uitgevoerd (incl. controles), wat is
de inhoud van elk staal, (3) resultaten worden in grafieken of tabellen uitgezet, (4)
analyse en statistiek van de testen, (5) bespreken van de meest opvallende resultaten,
(6) conclusie van het experiment en (7) mogelijk verder onderzoek om bv. andere
effecten aan te tonen.
Controles zijn heel belangrijk doorheen elk experiment. Positieve controle is het
nagaan of het testsysteem wel werkt → als je negatief resultaat hebt vooral belangrijk
→ als je iets niet kan waarnemen komt het dan door het staal of de test? → nagaan bij
een staal waar je van weet dat er hoge activiteit is. Negatieve controle is het nagaan of
het resultaat enkel en alleen het gevolg is van de test → bv. nagaan of er contaminatie
is → vooral bij positief resultaat → kijken naar een staal waar de test niet tot expressie
komt en gebruik van dezelfde middelen. Andere controles zijn vergelijken van
verschillende stalen voor normalisatie na te gaan → bv. testen op andere tijdstippen.
Oplossingen
Een oplossing is een homogeen mengsel van 1 of meerdere substanties (solute) in een
vloeibare component (solvent).
De concentratie geeft weer wat de hoeveelheid van elke substantie in een bepaalde
hoeveelheid solvent is: w/v, v/v, w/w (%) en ppm en ppb (g/cm³ bv.) → 1% NaCl is 1g
NaCl in 100ml/cm³ water en 8ppm CO in lucht is 8cm³ CO per miljoen cm³ in lucht.
Molariteit is het aantal mol per liter of dm³ en is de SI eenheid voor concentratie → 1
mol is de hoeveelheid van een substantie met 6,022*1023 moleculen (NA) en de
moleculaire massa (MW) is het aantal dalton → 1 dalton is 1/12 van m(12C) = Mr.
experimentele oplossingen bevatten echter redelijk lage concentraties: mM, µM en
nM. Een verdunning wordt gemaakt uit een hoog geconcentreerde oplossing mbv
formule: 𝑀1 ∗ 𝑉1 = 𝑀2 ∗ 𝑉2 → 3 variabelen zijn hierbij gekend.
Elektrolyten
Ionisatie is het uiteenvallen in ionen in een waterige oplossing. Sterke elektrolyten
hebben een irreversibele ionisatie → bij NaCl doordat deze samen worden gehouden
door ionaire verbindingen in kristal. Zwakke elektrolyten zijn dan wel reversibel
ioniseerbaar → bij carboxylgroep is deze al partieel positief (H in OH binding). Non
,2
Scheiding en zuivering van biomoleculen
elektrolyten ioniseren niet → alcoholen bv. Ionaire sterkte (µ of I) wordt bepaald door
1
het meten van de individuele ionen in een oplossing µ = (𝑐1 𝑧12 + 𝑐2 𝑧22 + ⋯ + 𝑐𝑛 𝑧𝑛2 ) =
2
1
∑ 𝑐𝑧 2 , met c de concentratie en z de lading van het ion.
2
Ionen zijn immers geladen en intrageren in oplossing → trekken elkaar aan en stoten
elkaar af met Coulomb krachten → beïnvloedt het gedrag van ionen → niet elk ion kan
afzonderlijk behandelt worden → gebruik van ionen activiteiten: 𝐴 = [𝑋] ∗ 𝛾 met A de
activiteit van de stof en γ de activiteitscoëfficiënt. γ is een maat voor de afwijking van
het ionisatiegedrag tgv de ionische sterkte → als µ stijgt zal γ dalen → de activiteit
daalt relatief tov de conc.
Zwakke elektrolyten
Deze zijn van biochemische belang → zuren en basen die slechts gedeeltelijk
geioniseerd in waterige oplossingen, zoals aminozuren, peptiden, eiwitten en
nucleïnezuren → de biochemische functie hangt af van de ionisatie in een bepaalde
pH.
Ionisatie van water is opgedeeld in waterstof en hydroxyl ionen → komen voor
volgens een equilibrium cte van 1,8*10-16 bij 24°C → lage activiteit dus de effectieve
conc. zijn gelijk aan de nominale conc. → adhv de molariteit (55,6M) van water
kunnen we de conc. v/d ionen berekenen → Kw=1*10-14 bij 24°C (lager bij lagere
temp. en hoger bij hogere temp.) → omdat [H+]=[OH-]=10-7 is de pH=log[H+].
Als we zout toevoegen aan H2O dan daalt de γ van OH- en H+ → de nominale conc. is
niet langer de effectieve conc. → door toevoegen van zout daalt de pH van water →
door invloed op ionisatiegedrag.
2. Celcultivatie en fractionatie
Celcultivatie
Celcultivatie = groeien van cellen onder gecontroleerde omstandigheden → artificieel
milieu met nodige nutriënten (cultuurmedium), groeioppervlak (recipiënt) en ideale
condities van T, vochtigheid en atmosfeer (incubator). Voordelen: ethischer dan
dierlijke experimenten, omzeiling complexiteit → exact dezelfde condities buiten voor
het te onderzoeken effect + geen hormonale en neuronale effecten, ….
Specifieke toepassingen
Screenen van nieuwe therapeutische compounds: geneesmiddelen dienen
getest te worden in verschilende fasen → pre-klinische fase: eerst testen in
cellen op toxiciteit, werking en efficiëntie en vervolgens in proefdieren (in
vivo, maar minder dieren nodig door voorafgaande in vitro testen).
Industrieel produceren van biomoleculen, zoals eiwitten, hormonen,
antilichamen, … → toepassen van recombinante DNA techniek.
,3
Scheiding en zuivering van biomoleculen
Ontwikkeling vaccins (kweek en massaproductie van virussen), fundamenteel
onderzoek in regeneratieve geneeskunde en stamcelonderzoek en in vitro
fertilisatie (1e groei van embryo is in vitro)
Soorten celculturen
Primaire celculturen
Rechtstreeks van een bepaald orgaan of weefsel geïsoleerd → weefsel wordt
gefractioneerd tot afzonderlijke cellen → vaak heterogene mix van celtypes. Bij
confluentie (geen plaats om verder te groeien) worden de cellen gesubcultiveerd →
losmaken en verdelen voor nieuwe groei → vanaf nu spreken we over een cellijn.
Cellen kunnen echter maar een beperkt aantal keer delen tot senescentie is bereikt →
niet meer prolifereerbaar → cellijn wordt eindig genoemd.
Voordelen: bootst sterk in vivo situatie na door cel-cel interacties die behouden
blijven → celtype kan groei- en stollingsfactoren uitscheiden voor ander celtype.
Nadelen: celculturen zijn eindig, cel-specifieke functies verminderen ifv de tijd
(functionaliteit is sterk afh. van #passages) en er is een beperkte beschikbaarheid
Voorbeelden: (1) fibroblasten: afkomstig van huid, groeien snel, adheren sterk
(productie EM) en niet persé nood aan groeifactoren, (2) lymfocyten: gescheiden dmv
evenwichtscentrifugatie (zie fractionatie), (3) niercellen: bekomen door nefrectomie
(chirurgisch verwijderen nier bij kankerpatiënten) en bevat verschillende celtypes, …
Permanente of continue cellijnen
Geïsoleerd uit tumoren of door transformatie van primaire cellen door inbracht van
oncogenen (immortaliseren). Ze hebben een hoge reproduceerbaarheid en lang
houdbaar bij invriezen → celbanken → commercieel verkrijgbaar.
Voorbeelden: (1) HeLa cellen: afkomstig van maligne baarmoederhalstumor en reeds
beschikbaar sins 1945, (2) CHO cellen: van eierstok chinese hamster, cel met
abnormaal aantal chromosomen (aneuploïdie), …
Basisapparatuur
Recipiënten
T flask: meest gebruikt, plastic waaraan
cellen makkelijk hechten en op groeien,
Roller bottle: fles draait rond voor betere
gasuitwisseling en heel het oppervlak
wordt benut, Spinner flask: draait enkel in
het midden en enkel geschikt voor cellen
die in een suspensie groeien (bv.
lymfocyten, HeLa, …) en celcultuurplaten:
cellen groeien op de bodem en vormen een
cellaag (monolayer) → vooral handig om
verschillende condities te onderzoek, bv.
invloed van conc. van een bepaalde stof.
, 4
Scheiding en zuivering van biomoleculen
Speciale recipiënten
Orgaan explant cultuur: vorm van primaire
celcultuur waarbij een stuk weefsel op een plaat
wordt gebracht voor behoud van cel-cel en cel-
matrix interacties. Cellulaire sferoïden: 3D structuur
voor beter onderling contact v/d cellen + creëren van
een micro-omgeving → door hanging drop, roterend
wandvat of clustering van endotheliale cellen.
Gepolariseerde epitheliale culturen: epitheliale
cellen laten groeien door basaal membraan
nabootsen met een poreus membraan. Artificiële
huid: bio-afbreekbaar gaas waarop fibroblasten
kunnen groeien, na een aantal weken worden
keratinocyten gebracht die dan beter groeien en
differetiëren. Microdragers: beads uit poreuze
polymeren voor cultivatie van adherente cellijnen.
Laminaire flow
Hierin gewerkt als men bezig is met celculturen. Er wordt een
steriel omgeving gecreëerd door passage van de lucht door een
HEPA (high efficiency particulate absorbing) filter. Laminaire
flow zorgt ervoor dat de lucht enkel langs de HEPA filter in de
kast terecht komt.
Incubator
Cellen worden hierin opgegroeid. De optimale temperatuur,
vochtigheid en atmosfeer (%O2, %CO2, …) kan worden
ingesteld. Vochtigheid door lade met water onderin en
atmosfeer geregeld dmv sensoren.
Groeivoorwaarden
Celcultuurmedium
De cellen groeien hierin → moet zo goed mogelijk in vivo omgeving nabootsen →
bevat hiervoor anorganische zouten, aminozuren, vitaminen, … Meestal wordt er ook
een serum (paard, rund, kalf) toegevoegd → bevat groeifactoren. Elk celtype heeft
echter andere noden → medium hieraan aanpassen:
Toevoegen van additieven zoals fosfaat voor vasculaire gladdespieren
Antibiotica voor selectiviteit
Serumfractie waarbij ongewenste factoren zijn verwijderd uit bep. serum
Serumvrij: heeft nadelen (arbeidintensief) en voordelen (minder kostelijk,
geen inhibitoren, …)
Meestal wordt aan het medium ook een buffer toegevoegd (natriumcarbonaat of
fosfaatbuffers) voor het constant houden van de pH → pH indicator zoals fenolrood
toegevoegd (rood bij neutraal, geel bij zuur, roos/paars bij base).
