Volledige samenvatting hoofdstuk 8 van methoden in het biomedisch onderzoek 3. Hoge punten al bewezen na gebruik van deze samenvatting, 16+/20!
Dirk zijn lessen ontcijferd tot een doorlopend verhaal dat heel begrijpbaar is.
Contents
8. Modulatie van genexpressie ............................................................................................................... 2
8.1 Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie ........................................................ 2
8.1.1. Antisense oligonucleotiden ................................................................................................... 2
8.1.2. RNA interference (RNAi) ........................................................................................................ 3
8.2. Gendisruptie, mutagenese en editing .......................................................................................... 6
8.2.1. Transposons........................................................................................................................... 6
8.2.2. Site Specific DNA recombinatie ............................................................................................. 9
8.2.3. Mutagenese ......................................................................................................................... 11
8.2.4. CRISPR.................................................................................................................................. 13
8.3. Ectopische expressie en overexpressie ...................................................................................... 28
8.3.1. Directe injectie van mRNA................................................................................................... 28
8.3.2. DNA vectoren ...................................................................................................................... 28
8.4. Gerichte proteïne degradatie ..................................................................................................... 30
8.4.1. Conditionele degrons .......................................................................................................... 31
8.4.2. Bifunctionele moleculen: PROTACs ..................................................................................... 32
8.4.3. TRIM away ........................................................................................................................... 32
8.5. Methoden van gentransfer ........................................................................................................ 33
8.5.1. Transfectie ........................................................................................................................... 33
8.5.2. Transductie .......................................................................................................................... 36
,8. Modulatie van genexpressie
DOEL:
- Functie en rol van eiwitten in fysiologie en pathologie bestuderen
- Doelwitten identificeren voor ontwikkelen van medicijnen die functie van genproducten
moduleren
8.1 Onderdrukking van genexpressie via antisense technologie
PRINCIPE:
- Gebaseerd op Watson-Crick base paring met mRNA sequentie
- 2 verschillende methodologiën
o Antisense oligonucleotiden (ASO)
o RNA interference (RNAi)
8.1.1. Antisense oligonucleotiden
Kort (8-50nt) enkelstrengig DNA (ssDNA) gericht tegen mRNA van gen waarvan men expressie wil
downmoduleren. RNA/DNA duplex. Onderdrukking van genexpressie via 3 complementaire
mechanismen.
- Approach 1: op niveau van pre-mRNA: gericht tegen
splicing motieven, poly-adenylation signaal.
- Approach 2: op niveau van mature mRNA:
o a) blockage van ribosome binding site, 5’ cap site,
translatie initiatie site
o b) RNase-H-afhankelijke target mRNA degradatie.
- Barrières voor toepassing:
o Opname in de cel en weefsel distributie moeilijk voor oligonucleotiden, opl.’en:
▪ Chemische modificaties: conjugatie met N-acetylgalactosamine (GalNac)
▪ Polymere nanopartikels: Poly lactic-co-glycolic acid (PLGA)
▪ Lipiden
o Stabiliteit: afbraak door nucleases, oplosssing voor bescherming tegen degradatie:
▪ Chemische modificaties: in phosphonate, suiker, base
o Toxiciteit
,8.1.2. RNA interference (RNAi)
RNA interferentie is het proces waarbij de expressie van een doelwitgen onderdrukt wordt door de
selectieve inactivatie van het mRNA door dsRNA. dsRNA wordt geprocessed tot ssRNA dat dan kan
hybridiseren met het doelwit mRNA. Dit is een proces dat reeds natuurlijk voorkomt in de cellen. (zie
ook miRNA)
Mechanisme van RNA interferentie:
, ➔(152) RNA interference (RNAi): by Nature Video - YouTube
siRNA zijn afgeleid van langere dsRNA die ofwel geproduceerd worden in de cel zelf of experimenteel
in de cel zijn binnen gebracht. De introductie van siRNA of dsRNA is veel gebruikt om gen expressie te
manipuleren. miRNA zijn een andere soort van RNA, de meeste miRNA komen van RNA’s die
getranscripteerd zijn in de nucleus, waar ze vouwen en geprocessed worden voor ze in het cytoplasma
terecht komen als double-stranded-precursor-microRNA’s.
De dubbelstrengige precursors van miRNA en siRNA binden aan Dicer, een endonuclease dat RNA knipt
in kleinere fragmenten. De meeste siRNAs en miRNAs zijn gemiddeld 21 nt lang. Het korte dsRNA bindt
dan een Argonaut proteïne (AGO2). 1 streng is geselecteerd en blijft gebonden aan het Argonaut, dit
is de guide-streng, de andere streng komt los en wordt gedegradeert. De combinatie van het RNA,
Argonaut en andere proteïnen noemen we het RNA-induced-silencing-complex of RISC.
siRNAs sturen RISC om te binden aan specifieke mRNAs. De targetting is specifiek want wordt bepaald
door de baseparen tussen het siRNA en het target mRNA. siRNAs hebben vaak perfecte
complementariteit met hun targetsites. Eens gebonden katalyseert Argonaut de knipping van het
mRNA, waardoor het mRNA dan gedegradeerd zal worden.
miRNAs sturen ook RISC naar mRNAs, meestal is maar een deel van de miRNA complementair met het
doelwit mRNA. Deze niet perfecte matching maakt het miRNA mogelijk om vele verschillende mRNAs
te targetten! Targeting via miRNA kan leiden tot de degradatie van mRNA of de inhibitie van de
translatie.
siRNA structuur:
- Commercieel verkijgbaar: custom of pre-designed, al dan niet gevalideerd (alternatief: In Vitro
transcriptie)
- Accumuleren voornamelijk in cytoplasma
- Knock-down is transiënt
- Delivery: verschillende methoden
Off-target effecten door interactie met de natuurlijke miRNA pathways
o miRNA niet 100% complementariteit nodig, aspecifieke downregulatie mogelijk
Immuunstimulatie als reactie op lang dsRNA of op delivery vesikel => algemene onderdrukking
van eiwitsynthese
Stabiliteit: onderhevig aan afbraak door nucleases
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper lukanys11. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €6,49. Je zit daarna nergens aan vast.
