100% tevredenheidsgarantie Direct beschikbaar na je betaling Lees online óf als PDF Geen vaste maandelijkse kosten
logo-home
Eerder door jou gezocht
Eerder door jou gezocht
logo
Samenvatting Deel 2 Moleculaire Technieken €4,49
In winkelwagen
Snel navigeren naar
Voorbeeld
  2.  
  3. Universiteit Utrecht (UU)
  4.  
  5. Genoom

Samenvatting

Samenvatting Deel 2 Moleculaire Technieken

3 beoordelingen
 6 keer verkocht
  • Vak
  • Genoom
  • Instelling
  • Universiteit Utrecht (UU)

Uitleg van moleculaire technieken van het vak Genoom Deel 2: van alle besproken DNA, RNA en eiwit-analyse technieken wordt de werking en de interpretatie van de resultaten van de techniek tot in detail besproken. De informatie uit hoorcolleges, werkcolleges, practica en Labstermodules zijn allemaal...

[Meer zien]

Voorbeeld 3 van de 19  pagina's

Document informatie

  • 24 januari 2018
  • 19
  • 2017/2018
  • Samenvatting

Onderwerpen

  • pcr
  • western blot
  • rt pcr
  • reverse transcriptase
  • restrictie enzym
  • gelelectroforese
  • sanger sequencing
  • dideoxy sequencing
  • hybridization
  • cdna
  • rna sequencing
  • sequencing
  • sds page
  • next generation sequencing
  • mu

Geschreven voor

  • Universiteit Utrecht (UU)
  • Biomedische Wetenschappen
  • Genoom
Alle documenten voor dit vak (47)

3  beoordelingen

review-writer-avatar

Door: nienkebmw • 6 jaar geleden

review-writer-avatar

Door: Tom1992 • 7 jaar geleden

review-writer-avatar

Door: dsoevermans • 7 jaar geleden

Verkoper

avatar-seller
michelleweesie

Ontvangen beoordelingen

Voorbeeld van de inhoud

Genoom deel 2 Moleculaire technieken

** Alle afbeeldingen uit deze weergave komen uit bronnen van het UMC Utrecht **

Week 7
HC Technieken: DNA, RNA
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces in de cel (= in levende omgeving): in vivo
Bestuderen DNA, RNA, eiwit of een proces uit de cel halen en bestuderen in een reageerbuis: in vitro

DNA-analyse technieken:
1. PCR
2. Restrictie-enzymen
3. DNA-gelelectroforese
4. Sanger sequencing: dideoxy sequencing
5. Next generation sequencing (week 9)

RNA-analyse technieken:
1. (In-situ) hybridization
2. cDNA maken
3. Kwantitatieve RT-PCR
4. RNAseq (RNA sequencing) (week 9)

Basisprincipe in veel DNA/RNA-analysetechnieken is hybridisatie.
1. Denaturatie: dubbelstrengs  enkelstrengs DNA of RNA
2. Renaturatie: enkelstrengs  dubbelstrengs DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA
3. Gebruik van primer/probe/oligo: enkelstrengs DNA voor detectie van complementair gebied
a. 20 nt is uniek


DNA-analyse
PCR
Twee doelen:
1) Selecteren van een sequentie
2) Amplificeren van een sequentie

Proces:
Selecteren specifieke, dubbelstrengse sequentie en heel vaak amplificeren. Uit elkaar halen strengen door
hele hoge temperatuur. Daarna gebruik van 2 primers: forward en reverse primer, dezelfde sequentie maar
ene is in spiegelbeeld van 3’ naar 5’. Primers binden aan 3’ van target sequentie (3’  5’): daarna m.b.v.
DNA-polymerase repliceren sequentie; de primer bevindt zich dus in de geamplificeerde sequentie. Na 1 e
paar cycli 2 dubbelstrengs DNA-moleculen die de sequentie bevatten, zijn geproduceerd. Uiteindelijk ook
productie van DNA-fragment van alleen specifieke sequentie, die daarna weer wordt geamplificeerd: zorgt
voor exponentiële toename.

PCR primers: complementair, specifiek en binden aan de grenzen van het DNA-fragment van interesse.
Benodigdheden voor PCR:
- Primers
- Nucleotiden
- DNA-polymerase
- DNA template
- Thermocycler: PCR machine

,Voorwaarden voor uitvoeren PCR:
- De uiteinden van het te vermeerderen stuk moeten bekend zijn
- Het stuk dat je wilt vermeerderen kan max. enkele duizenden bp groot zijn (tussen start en stop)

Restrictie-enzymen (endonucleases)
- Restrictie-enzym herkent sequentie in dsDNA
(dubbelstreng)
- Herkenning meestal via een symmetrische
sequentie
- Enzymen binden vaak als dimeer
o Verschil lineair en circulair DNA
 Lineair DNA:
 1x knippen = 2 fragmenten
 2x knippen = 3 fragmenten
 Circulair DNA:
 1x knippen = 1 fragment
 2x knippen = 2 fragmenten
- Door restrictie-enzymen kunnen er verschillende soorten uiteinden van de breuk ontstaan:
o Sticky 5’ end: overhang
o Sticky 3’ end: overhang (EcoRi, Hindlll)
o Blunt ends (Haelll): d.w.z. stomp, zowel het forward als reverse DNA-uiteinde zijn even lang

DNA-gelelectroforese
- Scheiding DNA-fragmenten op basis van grootte
o Gel werkt als een soort zeef/net
- Het patroon van DNA-fragmenten wordt de DNA-ladder genoemd
- Door een marker toe te voegen in 1 van de openingen, waar fragmenten van verschillende grootte
in zitten waarvan de grootte bekend is, creëer je een referentie: zo kun je de onbekende grootte van
de fragmenten afleiden door te kijken naar de plaats t.o.v. de marker in de gel
- Fragmenten migreren van – naar + pool
o DNA is negatief geladen
- Kleinste (in grootte) fragmenten migreren het snelste naar + pool
- DNA-fragmenten zijn net als gel bijna doorzichtig: DNA zichtbaar maken in gel m.b.v.:
o Ethiumbrome en UV-licht
o Radioactief 32P-gelabelde nucleotiden
o Fluorescent gelabelde nucleotiden
 Radioactief en fluorescent labelen zie Sanger sequencing

Dideoxy (Sanger) sequencing
Begin met PCR-reactie: DNA-fragment amplificeren
Verdelen over 4 reageerbuisjes en aan elk van de buisjes kleine hoeveelheid van 1 soort ddNTP toevoegen:
ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP = dideoxy d.w.z. i.p.v. OH, H-groep
In reageerbuisje vindt polymerase plaats van nieuwe DNA-fragmenten: als bij de polymerisatie door DNA-
polymerase i.p.v. dATP, een ddATP wordt ingebouwd, stop de verlenging van de DNA-streng: er kunnen
geen nieuwe nucleotiden meer worden ingebouwd. Door middel van gelelectroforese worden de
verschillende lengten DNA-fragmenten die hierdoor ontstaan van elkaar gescheiden.
- Zichtbaar maken DNA-fragmenten in gel bij Dideoxy sequencing door fluorescentie of radioactiviteit
o Ieder ddNTP heeft een eigen fluorescerende kleur
- Verhouding dNTP/ddNTP is belangrijk

, RNA-analyse
DNA/RNA-analyse o.b.v. hybridisatie + fluorescentie
- FISH: fluorescentie-in-situ-hybridisatie
o Om locatie van DNA-sequenties op mitotische chromosomen zichtbaar te maken
- In-situ hybridisatie
o Om aanwezigheid van specifieke RNA’s in bepaalde weefsels zichtbaar te maken (bijv.
muizenhersenen)

cDNA maken
Met behulp van reverse transcriptase en poly-T-primer: alle mRNA’s omzetten in dubbelstrengs DNA
- Poly-T-primer: alleen mRNA’s hebben een poly-A-staart, binden A-staart met T-primer
- Functies poly-T-primer:
o Startpunt voor reverse transcriptase ( primer)
o Alleen dubbelstrengs maken mRNA’s: andere soorten RNA hebben geen poly-A-staart
(herkenning mRNA’s)
Welke cDNA’s dit oplevert, is dus afhankelijk van de aanwezige mRNA’s: dit is dus variabel per weefsel en
conditie (momentopname)

Kwantitatieve RT-PCR
RT: reverse transcriptase
 Via PCR bepalen of een bepaald mRNA heel veel of juist heel weinig aanwezig was in de cel. Meten van
de fluorescentie tegen de tijd (aantal PCR-cycli en dus amplificatie van sequentie)
- Naarmate hoeveelheid dsDNA-fragmenten stijft, neemt de fluorescentie toe
- Hoe hoger de concentratie van een specifiek mRNA bij aanvang, hoe minder cycli er nodig zijn om
de maximale fluorescentie te bereiken
- Aantal benodigde cycli is een maat voor hoeveelheid mRNA

Efficiëntie van de technieken
Elk van deze analysetechnieken heeft zijn beperkingen: het doel is om de aanwezigheid van een sequentie,
de sequentie zelf, de hoeveelheid en de locatie van de sequentie te bepalen.
DNA:
1. PCR: aanwezigheid
2. Restrictie-enzymen: aanwezigheid
3. DNA-gelectroforese: aanwezigheid
4. Sanger sequencing (dideoxy): sequentie
5. Next generation sequencing (tijdens WC): sequentie
RNA:
1. (in-situ) hybridisatie: aanwezigheid, locatie
2. cDNA maken: aanwezigheid, sequentie (na sequencing)
3. Kwantitatieve RT-PCR: hoeveelheid
4. RNA-sequencing (RNAseq) (week 9): aanwezigheid/hoeveelheid/sequentie

Dit zijn jouw voordelen als je samenvattingen koopt bij Stuvia:

Bewezen kwaliteit door reviews

Bewezen kwaliteit door reviews

Studenten hebben al meer dan 850.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet jij zeker dat je de beste keuze maakt!

In een paar klikken geregeld

In een paar klikken geregeld

Geen gedoe — betaal gewoon eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard en je bent klaar. Geen abonnement nodig.

Focus op de essentie

Focus op de essentie

Studenten maken samenvattingen voor studenten. Dat betekent: actuele inhoud waar jij écht wat aan hebt. Geen overbodige details!

Veelgestelde vragen

Wat krijg ik als ik dit document koop?

Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.

Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?

Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.

Van wie koop ik deze samenvatting?

Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper michelleweesie. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.

Zit ik meteen vast aan een abonnement?

Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,49. Je zit daarna nergens aan vast.

Is Stuvia te vertrouwen?

4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)

Afgelopen 30 dagen zijn er 66184 samenvattingen verkocht

Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen

Start met verkopen
€4,49  6x  verkocht
  • (3)
In winkelwagen
Toegevoegd