DNA-structuur
HOOFDSTUK 7 : Moleculaire genetica
Overlappende disciplines :
▪ Genetica: erfelijkheidsleer + tot stand komen ervan (genotype, fenotype, overdracht)
▪ Moleculaire genetica: analyse van moleculen die de erfelijke eigenschappen bepalen
▪ Recombinant DNA-technologie: technieken waarbij DNA in de proefbuis gericht veranderd wordt en dan
terug in een organisme gebracht wordt = gentechnologie
▪ Moleculaire biologie: gentechnologie + genanalysetechnieken gecombineerd met biochemische en fysische
analysetechnieken (archeologie, evolutieleer, celbiologie, geneeskunde, …)
▪ Biotechnologie: combinatie van leven en technologie + toepassingen (bierbrouwen, …)
Definities :
Fenotype geheel van waarneembare kenmerken van een organisme, of één bepaald kenmerk (bv rood)
Genotype geheel van eigenschappen die chemisch vastliggen in de DNA-sequentie (bv AaBB)
Gen eenheid van overerving, reeks aaneengeschakelde nucleotiden, stukje DNA
Allel een bepaald gen komt in verschillende DNA-sequenties voor, dat is een allel (bv A en a)
Genoom geheel van erfelijk materiaal van een organisme
Klonen identieke nakomelingen van één organisme (ent, dier), of identieke DNA-moleculen (kopie)
Epigenetica genetica gebaseerd op het actief/tot uiting komen van allel en RNA- of eiwitveranderingen
Het fenotype wordt grotendeels bepaald door het genotype, maar ook door de omgeving zoals gedrag, obesitas,..
De omgeving heeft invloed op genen die coderen voor eiwitten die uiteindelijk het fenotype bepalen
Belangrijke factoren zijn:
- Tijd waarop het milieu inwerkt: embryonale fase latere leeftijd
- Opvoeding: karakter, ziektegevoeligheid
- Toeval
HOOFDSTUK 8 : DNA-structuur
Experimenten die aantonen dat erfelijke informatie op DNA ligt :
▪ Experimenten van Griffith
- 2 vormen van bacterie: S-vorm en R-vorm allebei dodelijk
- R-vorm wordt door afweersysteem herkent en vernietigt
- S-vorm niet, heeft een kapsel, wolf in schapenpak
▪ Experimenten van Avery
- Doet hitte gedode S-vorm samen met R-vorm → R-vorm pakt kapsel over = transformatie
Transformatie = genetische overdracht van DNA in competente cel (cel die DNA ontvangt)
▪ Experimenten van Hersey en Chase
- Tonen aan dat DNA wordt doorgegeven, niet eiwitten
▪ Watson en Crick: besluiten dat DNA drager is van genetische info met dubbele helix als structuur
,De chemische bouwstenen van DNA :
DNA is een nucleïnezuur: opgebouwd uit een aaneenschakeling van nucleotiden
(A-T), (G-C), (T-A), (C-G)
Nucleotide: fosfaatgroep + pentose-sacharide + aromatische stikstofbase (AUTGC)
Suiker + base (bv Adosine + pentose) = nucleoside
A gaat altijd met T samen en G altijd met C Wordt samengehouden door waterstofbruggen en
basenparen met complementaire basen A = T en G ≡ C
▪ A en G = purine basen
▪ T en C = pyrimidine basen
Reden dat A niet met G samengaat is omdat ze anders niet tussen de suikerfosfaatruggengraad passen
De structuur wordt gemaakt via
Fosfodiësterbindingen
5’ – 3’ richting dmv polariteit (geeft richting aan DNA en de genen)
Belangrijk voor DNA-verdubbeling en informatie-aflezing
Antiparallel structuur van 5’ naar 3’ uiteinde (OH)
De laatste stukjes van de DNA-puzzel
1928-1935 Pauling: theorie chemische bindingen
1945-1950 Chargaff: Basensamenstelling van DNA
Hoeveelheid A’s = T en G = T
G + C is constant voor species, niet voor soort
1950-1953 Wilkins en Franklin: x-straaldiffractie-
analyse
Ontdekking van helix structuur
DNA: een dubbele helix
▪ Twee polynucleotide ketens
▪ Stikstofbasen zijn hydrofoob, suikerfosfaten
hydrofiel
▪ H-bruggen tussen de stikstofbasen (zwak)
▪ Complementaire basen (A = T en G ≡ C)
▪ Anti-parallelle ketens
▪ 10 basen per draai
De basissequenties van bovenstaande figuur zijn: ▪ Rechtse helix heeft een grote en kleine groef
▪ 5’ TCAG 3’ = TCAG (L)
▪ 3’ GACT 5’ (L)
▪ 3’ CTGA 5’ (R)
▪ 5’ AGTC 3’ = AGTC (R)
,De DNA-structuur voldoet aan de voorwaarden voor genetisch materiaal :
▪ Chromosomen lange DNA-moleculen
▪ Gedecodeerde info A T G C, kan alle info met deze vier opslaan, molecule moet lang genoeg zijn
▪ Stabiliteit spontane vorming, de info zit beschermd aan de binnenkant van de helix
▪ Duplicatie, expressie obv de complementariteit van basen en de zwakke H-bruggen die worden losgemaakt
▪ Evolutie mutatie van basen
1 miljoen basen = 1 megabase = 1 Mb
1000 basen = 1 kilobase = 1 Kb
Genen en allelen :
Gen = aaneenschakeling van nucleotiden, info ligt erop, stukje DNA
Gen ligt op chromosomen, plaats waar gen op chromosoom ligt = genlocus
Gen ligt op beide homologe chromosomen op dezelfde hoogte
Verschillende variaties van het gen bv blauwe en groene oogkleur = een allel (B/b of G/g of ..), een allel kan:
▪ Dominant zijn (A), vanaf dat er 1 A in zit komt het kenmerk tot uiting (AA of Aa)
▪ Recessief zijn (a)
Een organisme kan
▪ Heterozygoot zijn voor een kenmerk (Aa)
▪ Homozygoot zijn voor een kenmerk (AA of aa) = raszuiver
Genotype = 2 allelen, beschrijft het kenmerk (AA, Aa, aa)
Fenotype = hoe het kenmerk tot uitting komt (75% A, 25% a)
Met het genotype kan je altijd het fenotype bepalen maar niet omgekeerd
Van basentaal naar aminozuurtaal → adhv codon(combinatie van 3 nucleotiden bv ATC)
Hebben 64 codon combinaties (4³) voor 20 aminozuren → gedegenereerd (redundant): je hebt meerdere codes die coderen
voor hetzelfde aminozuur, omgekeerd geldt dit niet! Genetische code is dus specifiek
3 nonsense codons (stopcodons): UAA, UAG, UGA
61 sense codons waarvan 1 een startcodon ATG, AUG bij mRNA
Leest van 5’ naar 3’, begint bij een startcodon, schuift telkens drie basen per keer (codon) op en stopt bij het
stopcodon
= open leesraam ORF, altijd van 5’ naar 3’
Is universaal, kan met open leesraam van een mens een menselijk eiwit produceren in een bacterie
Niet al het afgeschreven DNA leidt tot de synthese van eiwitten = ncRNA of niet-coderend RNA
SNP’s = single nucleotide polymofismen = eenvoudige verschillen in DNA-sequenties
Bv ATTC en ATGC
. TAAG TACG
, HOOFDSTUK 9 : Restrictie en hybridisatie
Hybridisatie :
Hybridisatie: gemerkt stukje enkelstrengig DNA dat complementair is aan de sequentie die opgespoord moet
worden(de probe), vindt de complementaire DNA streng en basenpaart ermee
1. Denaturatie: Twee stengen worden van elkaar gescheiden in de dubbele helix door hitte of pH verhoging
2. Renaturatie: Complementaire basen binden automatisch na temperatuur of pH verlaging
3. Hybridisatie: Na toevoeging probe kan deze basenparen met overeenkomstig complementair DNA-fragment
Naargelang de zoutconcentratie en temperatuur (stringentie) kun je een perfecte match (volledig complementaire
strengen die basenparen) hebben of een mismatch
Toepassing hybridisatie:
▪ Voor identificatie van bacteriële of gistkloon die een bepaald stukje DNA bevat → koloniehybridisatie
Kolonies van plaat naar een membraan overgebracht en dan gehybridiseerd en geanalyseerd wordn op
de dot blot
▪ Analyse van SNP’s dmv hybridisatie op een dot blot = druppeltjes DNA op een nylonmembraan
▪ Wordt een korte probe (20 nucleotiden lang) en stringente hybridisatiecondities gebruikt zodat enkel een
perfect complementaire probe hybridiseert
▪ Is 20 nucleotiden lang om bv allelen te onderscheiden = ASO’s = allel-specifieke oligonucleotiden, ze kunnen
hierdoor specifieke mutaties opsporen en een beeld van het genotype krijgen door combinatie van
duizenden ASO’s op een chip
▪ Werking
Op het membraan worden druppeltjes gedenatureerd DNA van een organisme gefixeerd
Daartegen wordt een gelabelde ASO gehybridiseerd
Overmaat van probe wordt weggewassen en het resultaat wordt geanalyseerd achter enkele uren
De homozygote mutant heeft twee mutante allelen en hybridiseert dus enkel tegen de mutante ASO
Restrictie-enzymen :
= endonuclease: eiwit dat een specifieke dubbelstrengige DNA-sequentie (herkenningssequentie) herkent en
vervolgens het DNA knipt, je krijgt dan de restrictiefragmenten
Het enzym zal zowel in de 5’ – 3’ als de 3’- 5’ streng knippen
▪ Stompe, blunt uiteindjes → mooi in twee genkipt
▪ Overhangende, sticky uiteindjes : vb hiernaast
De herkenningssequentie is vaak 4-6 basenparen lang en een palindroom bv AGTACT
De bekomen DNA-fragmenten kunnen volgens grootte onderscheiden worden door gelelektroforese
