H1: Inleiding
Biologische systemen: micro-organismen, plantaardige of
dierlijke cellen, tevens enzymen geïsoleerd uit levende wezens
o Micro-organismen: bv. schimmels
o Enzymen geïsoleerd uit levende wezens: bv. mRNA vaccins
Geen klassiek biotechnologisch product: niet aangemaakt in levende cellen
Het gaat niet over ‘wat is het product’ maar over ‘hoe is het aangemaakt’
o NIET: traditionele agricultuur en veeteelt
Biotechnologie: gebruik en manipulatie v. biologische systemen
o Bereiding natuurlijke grondstoffen en biomassa
o Het gaat niet over ‘wat is het product’ maar over ‘hoe is het aangemaakt’
Aanmaak via chemische synthese: chemische risico’s
Aanmaak via biologische synthese: biologische contaminanten (=stoffen die onbedoeld
ergens terechtkomen)
Vroeger: onbewust gebruik maken van bacteriën en gisten
o L. Pasteur: micro-organismen zijn verantwoordelijk voor bepaalde omzettingen
o Bv. verkeerde gisten in druiven tijdens productie wijn: omzetting in azijn ipv wijn
Fermentatie
o Afbraak nr kortere ketens suikers
o Opkoken: micro-organismen die spontaan aanwezig zijn, afdrogen
o Gisten toevoegen, gisten gebruiken suikers en zetten om naar CO 2 en alcohol
Gisten kunnen max. 12-13% alcohol aan, anders toxisch voor gistcel
Exponentiële toename v. gisten
Conc alcohol stijgt, conc gisten daalt (alcohol is afbraakproduct v. gisten)
DNA manipuleren
o Wijzigingen (in het genoom) v. bepaalde cellen
o Recombinante proteïnen aanmaken op industriële schaal
o Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
o Recombinante technieken
Vaccins, mAb & enzymen
o Gewone biologicals: bv. bloedafgeleide producten
Deel plasma opgezuiverd om als GM te gebruiken
o Biotechnologische producten: bv. bepaalde antibiotica, bepaalde vaccins
Aanmaak: micro-organismen manipuleren zonder genetische informatie te wijzigen
o Recombinante producten: bv. insuline
Menselijke eiwitten produceren + gebruiken als GM
Insuline
o Aanmaak in zeer beperkt aantal cellen
Gen dat hiervoor codeert wel aanwezig in alle cellen, maar wordt enkel geproduceerd
door β-cellen in de pancreas
o Genen in genoom worden gestuurd door promotoren
Af-/aanzetten promotoren door omgevingsfactoren, daardoor zorgen ze ervoor dat
sommige β-cellen wel insuline aanmaken en andere niet
o In het begin geen methionine (=startcodon)
, Eiwitten onderworpen aan post-translationele modificaties (eiwit synthetiseren en
wijzigen)
Stuk wegknippen van het eiwit
Start: signaalsequentie zorgt ervoor dat eiwit
ergens in het lichaam terechtkomt, wordt er
afgeknipt
o A-keten en B-keten met daartss. een connecting peptide
(posttranslationeel: wegknippen)
Insuline actief in lichaam: enkel A- en B-keten
Door disulfidebruggen aan elkaar gehouden
Interne disulfidebrug
Analyse biogene producten: belangrijk kwaliteitscontrole
o Risico op contaminatie
o Analyse eiwitten complexer dan analyse klassieke GM
H2: DNA/RNA
DNA-structuur:
Primaire structuur = polynucleotide-structuur (oligonucleotide)
o Met 3’-5’-fosfodiëster verbinding tss. nucleotiden
o Suiker-fosfaatskelet met basen gebonden op C 1’ vd. suikermolecule
o Basen bepalen DNA-sequentie
Secundaire structuur = 2 anti-parallelle ketens
o Watson en Crick model
o Dubbelstrengig
Enkele virussen enkelstrengig DNA
Gebieden v. complementariteit met zichzelf
Interne dubbele helix haarspeld structuren
o 5’ 3’
o Ketens samengehouden door H-brug vorming tss. complementaire basen
A – T (dubbel gebonden)
G – C (driedubbel gebonden)
A & G: purines
C & T: pyrimidines
Veel genomen: circulaire DNA-moleculen
o Bv. bacteriële genomen, sommige virussen, sommige bacteriofagen & plasmiden
o Plasmiden: los van eigen genoom mee overgeërfd
o Bacteriofagen: fasen in leven waarbij DNA circulair is, fasen in leven waarbij DNA niet
circulair is
o Voor delen: DNA verdubbelen
o Genoom mens: lineair, bij DNA-replicatie en celdelingen een extra probleem
NIET bij circulair genoom
Denaturatie-Renaturatie
Denaturatie
o Reversibel proces
o Originele structuur gaat verloren
o H-bruggen worden verbroken (2 strengen laten los)
, Thermisch: opwarmen & afkoelen
Onbeperkt herhalen
pH wijziging: H-brugvorming is afh. vd. pH van het milieu
pH zuur: DNA-strengen laten los
pH alkalisch: DNA-strengen komen terug samen
Te sterk zuur of te sterk alkalisch: DNA breekt af
Chemische moleculen onderhevig aan afbraakreacties
Toevoegen additionele stoffen aan buffer
DNA-strengen destabiliseren door ureum of formamide
Tm: smelttemperatuur
o Temperatuur waarbij helft vd. basen ongepaard zijn (2 strengen niet volledig los van elkaar)
o Tm stijgt naartmate [G][C] gehalte toeneemt
A-T: 2 H-bruggen worden gevormd
G-C: 3 H-bruggen worden gevormd
Hoe meer G-C bindingen, hoe stabieler de binding, hoe meer E toevoegen om ze uit
elkaar te krijgen, Tm stijgt
o Renaturatie
Gedenatureerde strengen associëren opnieuw bij 25°C onder Tm
o Volledig denatureren (afbreken, T verhogen) renaturatie tot Tm (helft basenparen
ongepaard)
Tm-waarde volgen en meten (want hoeveelheid licht verandert in enkelstrengige vs.
dubbelstrengige configuratie) zie grafiek
o Spectofotometer
o Cuvet zonder toegevoegde vloeistoffen en absorptie meten bij 260 nm
o Waarde absorptie bij kamerT = 1
o Cuvet geleidelijk aan opwarmen
o Relatieve absorptie blijft 1 (tem. 60°C blijft absorptie hetzelfde als bij kamerT)
o Verder opwarmen: absorptie neemt toe (ongeveer 1,4)
Basen in dubbelstrengige DNA molecule is in totaliteit iets minder absorberend dan
dezelfde basen in een enkelstrengige DNA molecule (enkel: absorptie stijgt)
o Tm: helft basen enkel., helft basen dubbel. (helft van de curve)
o Verder verwarmen: curve wordt plateau
Dit voorbeeld: alle DNA is enkel. geworden bij 75-80°C
Onder 94°C: niet-natuurlijk stuk DNA (poly d(A-T)), bestaat uit dubbel. dat enkel uit A-
en T-basen bestaat, enkel 2 H-bruggen)
Dit is de zwakste binding die we kunnen hebben
94°C: volledige denaturatie
Onder Tm: volledige renaturatie
Grafiek rechts: correlatie tss Tm en percentage [G][C]
o 0% [G][C]: Tm is ongeveer 70°C
o 50% [G][C]: Tm is ongeveer 90°C
o 100% [G][C]: Tm is >100°C
o 94°C: al het natuurlijk DNA uit levende organismen
is gedenatureerd
o Spectrofotometer: hoeveelheid DNA inschatten
Absorptie UV-licht
1 OD260nm = ongeveer 50 µg/ml dubbelstrengig
DNA (Wet Lambert B.) + ongeveer 33 µg/ml
enkelstrengig DNA (schatting)
Zuiverheid DNA: verhouding OD260/OD280 = 1,8 (bij zuiver DNA)
OD = optische densiteit
, Absorptiespectrum: over een range van golflengtes opnemen hvl stof absorbeert bij
desbetreffende golflengtes in grafiek
Reversibel proces
o 94°C: DNA-strengen komen los van elkaar = denaturatie
o T ver onder Tm: DNA-strengen komen terug bij elkaar = renaturatie
Renaturatie beïnvloedt door: spelen met T + toevoegen v. kationen
Hoe hoger conc. v. DNA, hoe sneller renaturatie doorgaat
Homologe renaturatie
o Met volledig stuk complementair DNA (2 complementaire strengen; geen foutieve basen)
Conc. DNA hoger sneller
Strengen dichter bij elkaar sneller
o Kationen verlagen elektrostatische afstoting renaturatie hogere Tm
2 DNA strengen: relatief hoge negatieve lading door fosfaat-suiker skelet
Fosfaatgroep erop zijn bij fysiologische pH ook negatief geladen
Kationen zorgen voor neutralisatie elektrostatische afstoting
Heterologe renaturatie
o Met niet volledig identisch of complementair stuk DNA (fout tijdens renaturatie)
o Tm: -1,4°C/per mismatch (mismatch = fout in complementariteit tss. 2 strengen)
Indien fout in complementariteit tss. 2 strengen die je samen wilt laten komen
T waarbij je renatureert moet je lager zetten dan bij homologe renaturatie
Primers toevoegen (enkelstrengig) mengen met DNA-staal patiënt (staal dat je wilt testen)
o Stukken renatureren met DNA patiënt door afkoeling tot onder Tm-waarde
o Synthetische stukken: volledig of deels complementair
DNA-replicatie = vermenigvuldigen v. DNA
Voor celdeling: beide dochtercellen die ontstaan hebben volledig genoom
o Snelheid: 50 nucleotiden/sec.
Gebeurd op iedere plaats in genoom waar replicatie start
Genoom: bestaat uit chromosomen replicatie start tegelijk op beide chromosomen
Snelheid is dus sneller: 50 nucleotiden/sec. gebeurd op verschillende plaatsen in
genoom + gaat in 2 richtingen
o DNA-basenparing: A-T, G-C
Complementariteit
o DNA-templating: DNA-strengen gaan uit elkaar tijdens replicatie
Denaturatie zonder verwarmen, dmv. enzymen
Beide strengen gebruiken als template
o DNA-polymerase
3’-5’ richting
Strengen uit elkaar trekken
Nieuwe complementaire strengen aanmaken
Exonuclease activiteit: stukje RNA primer wegknippen + vervangen door DNA-streng
Thv. Okazaki-fragmenten
o dNTPs = deoxyribonucleotide trifosfaten
Bouwstenen, voldoende nodig om snelheid v. inbouwen vd. nucleotiden te behouden
o Semi-conservatief
Nieuwe dubbele streng: nieuwe streng + oude streng
o Replicatievork
Asymmetrisch
‘leading’ streng
‘lagging’ streng
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper marthevanlerberghe. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €10,49. Je zit daarna nergens aan vast.