Methoden in biomedisch onderzoek 2
Hoofdstuk 2: Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
- Zeer breed gamma aan vraagstellingen:
o Fysiologie (hoe werkt het lichaam?) ↔ pathologie (wat loopt fout?)
- Verschillende niveau’s: organisme – weefsel – cel – subcellulair
o Mens zelf of modelorganismen (rhesusaap, muis, cavia)
- Open exploratief onderzoek ↔ hypothese gedreven onderzoek
- Stroom onderzoeken: fundamenteel onderzoek → translationeel onderzoek → klinisch onderzoek
- Onderzoeken in vivo, ex vivo, in vitro of in silico
Hoofdstuk 3: RNA
1. Inleiding
- RNA is korter dan DNA, nucleotiden bevatten 2’ OH-groepen (vatbaar voor RNasen)
- Meestal enkelstreng, mogelijk in secundaire (2D) of tertiaire (3D) structuur
- Verschillende vormen RNA: coderend (mRNA) of niet-coderend (ncRNA)
o Non-coding rRNA (ribosomaal RNA) is 80-95% van totale massa
- Structuur: RNA wordt van DNA afgeschreven, complementair aan de matrijs met T→U
o Bevat geen intronen door splicing van pre-MRNA
o Bevat een polyA-staart
2. Werken met en bewaren van RNA: voorzorgen
- Mogelijke problemen
o RNA-profiel veranderd na staalname
o RNA-degradatie door endogene of exogene RNasen
o DNA-contaminatie: scheiding DNA/RNA meestal onvolledig
- Staalname
o Keuze anticoagulans: best EDTA, heparine inhibeert DNA/RNA reacties
o RNA-stabilisatie: degradatie of verandering voorkomen
▪ Onmiddellijk invriezen (vloeibare stikstof)
▪ Totaal bloed: in vacuümtube met RNA-bewaarmiddel
▪ Cellen/weefsel: in een RNA-bewaarmiddel
- Staalverwerking: RNase-vrij werken (filtertips, milliQ-water, RNase inhibitoren)
- Bewaring: tot 1 jaar in -80 °C in RNase-vrij water of langer als alcoholprecipitaat
- DNA-contaminatie: niet altijd een probleem, wel wanneer enkel RNA geanalyseerd wordt
o Detectie: RTmin controle of elektroforese
o Verwijderen: DNase behandeling: tijdens of na RNA-extractie
▪ Enzym inactiveren of verwijderen na behandeling
▪ Nadeel: mogelijk ook RNA-beschadiging
3. RNA extraheren
- Algemeen 3 stappen: lysis-isolatie-oplossen/concentreren
- Methode afhankelijk van het startmateriaal en doel (hoeveelheid, zuiverheid, aantal stalen)
- Lysis
o Remmers van niet-gewenste moleculen toevoegen (DNasen, proteasen…)
o Meest gebruikt: detergenten zoals SDS, guanidium thiocyanaat
o Vriezen-ontdooien, mechanische homogenisatie (bevriezen in stikstof en vermalen), vloeibare
homogenisatie (oplossing tussen glaasjes) of sonicatie (geluidsgolven) worden ook gebruikt
,- RNA extractie met organische solventen: scheiding op basis van verschillende oplosbaarheid in
verschillende oplossingen
o Trizol: guanidium thiocyanaat-phenol (= lysis en RNase inhibitor)
o Methode is een guanidium thiocyanaat-phenol-chloroform extractie, gevolgd door een
alcoholprecipitatie van RNA uit de waterfase of scheiding op een kolom
▪ ! in zure omstandigheden: verschil in pH en lading DNA/RNA zorgt voor scheiding
• RNA in waterlaag
• DNA in organische laag
- Alcohol precipitatie: idem als DNA alcoholprecipitatie, zowel opzuivering (ontzouten, verwijderen
detergentresten…) als concentratie van RNA
- Extractie dmv kolomchromatografie (silica kolom)
o Principe: zout- en pH-condities zorgen voor selectieve binding van RNA aan matrix in de kolom,
na elutie (obv zwaartekracht, centrifugeren of vacuüm) van niet-bindende moleculen worden de
condities veranderd en komt RNA los van de kolom
o ! verwijdering van DNA niet 100%
o Zouten: chaotrope zouten=RNase inhibitoren
o Automatisering: met magnetische silicabeads die RNA binden, magneet tegen kolom en rest
aspireren
4. RNA kwantificeren
- Als inschatting van opbrengst en kwaliteitscontrole
- ! hoeveelheid RNA verschilt per cel/weefseltype
- Spectrofotometrie
o Voordeel: snel, eenvoudig, concentratie én zuiverheid
o Nadeel: aspecifiek, mogelijke overschatting, geen onderscheid DNA/RNA
o Concentratie bereken adhv Lambert-Beer (bij 260nm)
- Fluorimetrie: fluorescente kleurstof bindt selectief aan DNA of RNA (SYBR Green, Ribogreen)
o Voordeel: selectiever voor RNA, nauwkeuriger, gevoeliger
o Nadeel: duurde en omslachtiger
- Elektroforese: RNA migreert van negatieve naar positieve pool door matrix bij agarose elektroforese.
Capillaire elektroforese met fluorescente kleurstof.
o Voordeel: concentratie, intactheid en lengte
o Nadeel: enkel semikwantitatief bij agarose, duur bij capillair
5. RNA concentreren
- Alcoholprecipitatie of kolom
- Met concentrators: centrifugatie door een filter die scheidt volgens grootte
- Speedvac: concentratie door verdamping van het solvent in een centrifuge onder vacuüm
,6. RNA in vitro aanmaken
- Korte fragmenten: RNAi aanmaken, lange fragmenten: bestuderen van RNA structuur en interacties
- In vitro transcriptie: mbv DNA-afhankelijke RNA polymerasen van bacteriofagen (DNA als template)
o Mogelijke templates: plasmide, PCR-amplicon, cDNA
o Initiatie: binding Pol aan promotor
o Elongatie 5’ → 3’ (U ipv T)
o Terminatie: terminatie-signaal of einde DNA fragment
7. RNA reverse transcription
- Reverse transcriptasen: RNA-afhankelijke DNA polymerasen (retrovirussen, telomerasen)
o RNaseH activiteit: breekt RNA-cDNA hybriden af
- In vitro: RNA → complementair DNA (cDNA) voor verder onderzoek
- Reactie
o Reagentia: RNA-template, reverse transcriptase, primers, dNTPs, buffer (met DDT en een
RNase inhibitor), nuclease-vrij water
o Reactieverloop: annealing – primerextentie en DNA polymerisatie – enzyme inactivatie
- Primers zijn complementair met PolyA van mRNA (heeft 3’ bias) of random primers (gelijkere
vertegenwoordiging)
- Genspecifieke primers worden gebruikt voor aanrijking weinig abundante targets
- cDNA kloneren: expressievectoren aanmaken en een library aanleggen
o Dubbelstreng cDNA nodig: synthese 1 e en 2e streng door RT, daarna PCR
o 4 manieren
▪ Blunt end cloning: synthese 2 strengen + ligatie van blunt ends in vector
▪ Directioneel: tijdens cDNA synthese extra seq. toevoegen om in vector te passen
▪ Ligatie-onafhankelijk: 3’ overhangende polymeer zorgt voor stabiliteit, ligatie niet
noodzakelijk, gebeurd tijdens transformatie in bacteriën
▪ Gen-specifiek: PCR fragment kloneren in plasmide
- Rapid amplification of cDNA ends (RACE): snelle amplificatie voor specifiek target tussen gekende
sequentie
o RT gevolgd door PCR: combo gen-specifieke primer en algemene primer
o Toepassing: onderzoek van alternatieve promotoren, transcriptie-start sites, alternatieve
splicing en verwante mRNA moleculen
o Vervangen door Next-gen sequencing
, 8. RNA analyseren
- Humaan genoom en transcriptoom: ong 20k genen en 200k transcripten
- Doel: transcripten identificeren, genexpressie meten
- Northern blot: RNA scheiden op denaturerende gel, blotten naar membraan, radioactief- of
fluorescent-gelabelde probe hybridiseren en detecteren met autoradiogram of laser
o Voordelen: probe hoeft geen 100% match te zijn → mogelijkheid om homologe RNA’s te zoeken in
andere species, geen omzetting nodig tot cDNA
o Nadelen: werkt slecht op partiëel gedegradeerd RNA, gelijkaardige fragementen geven dikke
banden die niet te scheiden zijn, oude technologie
- Kwantitatieve PCR: qPCR en RT-qPCR (reverse transcriptase): detectie van PCR-amplicons obv
fluorescentie (dye-based of probe-based)
o Fluorescentie komt overeen met #kopieën
o Plot hoeveelheid PCR product tov cyclusgetal: Ct=treshold cycle → waar fluorescentie
detecteerbaar wordt
▪ Hoe lager de Ct, hoe meer RNA in initiële reactie zat
o Kan 1 of 2-staps: RT-reactie en qPCR samen of apart
o Absolute kwantificatie adhv een standaardcurve van verdunningsreeks
o Efficiëntiebepaling (E): fractie van moleculen die gecopieerd wordt in 1 cyclus
▪ Nx=N0(1+E)x met Nx= aantal moleculen na x-cycli en N0 het origineel aantal targets
▪ Efficiëntie afhankelijk van primer en template structuur, reagentia concentraties,
reactiecondities, polymerase-inhibitie
o Relatieve kwantificatie: ΔΔCt methode = ΔCt teststaal- ΔCt referentiestaal
▪ RQ (relative quantity)= 2^-ΔΔCt
- ddPCR (droplet digital PCR): PCR in micellen met probe- of dye-based endpoint detection
o #templates per cel is Poisson verdeeld!
o Kan vanaf 10% verschil in expressie meten
- RNA-FISH: fluorescence in situ hybridisation: gemerkte probe hybridiseerd met cellen of
weefselcoupe: laat toe expressie te lokaliseren in weefsel
o Kan single-molecule (smRNA-FISH): detectie van individuele RNA transcripten,
signaalamplificatie nodig
o In multiplex met verschillende probes
- In situ PCR: op cellen of weefselcoupe: expressie lokaliseren
o Primers met hapteen-label worden gecapteerd door antistof tegen het hapteen