Inleiding tot biotechnologie & genetica
Inhoudsopgave
1 Inleiding: biotechnologie ........................................................................................... 3
2 Basisbegrippen/technieken in biotechnologie & genetica ........................................... 7
2.1 DNA-RNA ..................................................................................................................... 7
2.1.1 dna-structuur .................................................................................................................................. 7
2.1.2 denaturatie – renaturatie ................................................................................................................ 8
2.1.3 DNA-replicatie ............................................................................................................................... 11
2.2 De “polymerase chain reaction”: PCR .......................................................................... 15
2.2.1 principe van de pcr-reactie ............................................................................................................ 15
2.2.2 chemische synthese van dna ......................................................................................................... 18
2.2.3 uitvoering van de pcr reactie ......................................................................................................... 23
2.2.4 Taq polymerase ............................................................................................................................. 26
2.2.5 oorsprong van dna voor de PCR reactie ........................................................................................ 27
2.2.6 gebruik pcr (toepassingen) ............................................................................................................ 27
2.3 DNA mutaties en herstelmechanismen........................................................................ 39
2.3.1 DNA mutaties ................................................................................................................................ 39
2.3.2 herstelmechanismen ..................................................................................................................... 43
2.4 DNA sequenering ....................................................................................................... 46
2.4.1 SAnger sequencing ........................................................................................................................ 46
2.4.2 cycle-sequencing ........................................................................................................................... 49
2.4.3 NGS – next generation sequencing ............................................................................................... 52
2.5 Restrictie enzymen (RE) .............................................................................................. 53
2.5.1 DNA ligase ..................................................................................................................................... 54
2.5.2 restrictiemappen ........................................................................................................................... 55
2.6 Isolatie van een gen .................................................................................................... 56
2.6.1 belangrijkste methode (isolatie gen) ............................................................................................. 56
2.6.2 alternatief: synthetisch aanmaken ................................................................................................ 58
2.6.3 geïsoleerd mrna cdna ............................................................................................................... 59
2.6.4 cdna in plasmide brengen ............................................................................................................. 60
2.6.5 reverse trancriptase gelinkt aan polymerase chain reactie (RT-PCR) ............................................ 64
3 De eukaryote celkern ............................................................................................... 67
3.1 De eukaryote cel en haar celkern ................................................................................ 67
3.2 Structuur vh chromosoom .......................................................................................... 69
3.2.1 chromosomale eiwitten / opvouwing DNA ................................................................................... 70
3.2.2 telomeren ...................................................................................................................................... 72
4 RNA & transcriptie................................................................................................... 74
4.1 Transcriptie in PROKARYOTEN ..................................................................................... 74
4.1.1 transcritpie (prokaryoten) ............................................................................................................. 74
4.1.2 RNA polymerase (prokaryoten) ..................................................................................................... 75
4.1.3 initiatie (prokaryoten) ................................................................................................................... 76
4.2 Transcriptie in EUKARYOTEN ....................................................................................... 77
4.2.1 rna-polymerase (eukaryoten) ........................................................................................................ 78
1
, 4.3 tRNA .......................................................................................................................... 79
4.3.1 structuur trna ................................................................................................................................ 79
4.3.2 genetische code = degeneratief .................................................................................................... 80
4.3.3 koppeling az (met trna) ................................................................................................................. 81
4.4 rRNA & de ribosomen ................................................................................................. 82
4.4.1 rRNas + ribosomale EW ribosomen .......................................................................................... 84
4.5 mRNA ........................................................................................................................ 86
4.5.1 modificaties mRNA (eukaryoten) .................................................................................................. 87
4.5.2 einde eukaryotisch mRNA ............................................................................................................. 88
4.6 Splicing ...................................................................................................................... 90
4.6.1 splicing door spliceosoom ............................................................................................................. 92
5 Eiwitten & de translatie ........................................................................................... 93
5.1 Eiwitten – inleiding ..................................................................................................... 93
5.2 Eiwitsynthese ............................................................................................................. 93
5.2.1 eiwitsynthese bij PROKARYOTEN .................................................................................................. 93
5.2.2 eiwitsynthese bij eukaryoten ...................................................................................................... 100
5.3 De genetische code....................................................................................................102
5.4 Genregulatie in bacteriën (PROKARYOTEN) ................................................................102
5.4.1 induceerbare genen .................................................................................................................... 103
5.5 Genregulatie bij EUKARYOTEN ...................................................................................105
6 Recombinant DNA ..................................................................................................107
6.1 Plasmide klonerings vectoren ....................................................................................107
6.1.1 F plasmiden ................................................................................................................................. 108
6.1.2 R plasmiden ................................................................................................................................. 109
6.1.3 eigenschappen plasmide kloneringsvectoren ............................................................................. 110
6.1.4 voorbeelde plasmide kloneringsvectoren ................................................................................... 110
6.2 Faagvectoren.............................................................................................................117
6.3 Cosmide vectoren ......................................................................................................120
2
,1 Inleiding: biotechnologie
Gebruik & manipulatie v biologische syst ter (industriële) bereiding v natuurlijke
grondstoffen & biomassa
Biologische systemen: micro-org, plantaardige/ dierlijke cellen, enzymen geïsoleerd uit
levende wezens
NIET: traditionele agricultuur & veeteelt
• Kruisen planten & dieren zonder genetische manipulatie ≠ biotech
mRNA vaccins = geen klassiek biotech prod (want w niet aangemaakt in levende cellen)
Biotech prod?
• Niet zozeer: wat is product?
• Maar: hoe w prod aangemaakt?
▪ Synthetisch geen biotech prod
Biotech prod: potentieel gecontamineerd met vb virussen
Onderscheid GM’en:
▪ Aangemaakt via chemische synthese
▪ Aangemaakt via biotech processen/ rechtstreeks biologisch
EERSTE PERIODE
Biologische systemen reeds 1000’en jaren gebruikt
• Tijdperk: op onbewuste wijze gebruik gemaakt v bacteriën & gisten:
▪ Productie levensmiddelen: bier, wijn, kaas, yoghurt, azijn
▪ Eindigt +-1850: L.Pasteur micro-organismen verantwoordelijk vr
bepaalde omzettingen (suikers => alcohol, verzuring wijn)
• Zo: kon bewust gebruik maken v biologische systemen
• Maar: techniek om contaminaties met vreemde org nog niet
gekend (vreemde org op spontane wijze contaminatie)
• Wijn: als in druivensap verkeerde micro-org wijnazijn ipv wijn (suikers azijn
ipv alcohol)
▪ Na Pasteur: doelbewust gisten selecteren wijn
Bier brouwen:
• Relatief gecontroleerde manier vr gebruik micro-organismen & gisten
• Omkoken: micro-org die spontaan aanwezig zijn, w afgedood
• Fermentatie: door toevoegen v geselecteerde gisten => prod alcohol + CO2
• Als alle suikers => alcohol gisten breken af
• Alcohol = toxisch vr gisten gisten breken af (daarom bier max 13% alc)
• !! toevallige micro-org groeien er bij (toevallige contaminatie) !!
3
,TWEEDE PERIODE
Start: na ontdekking L. Pasteur
Introductie industriële processen om grote hoeveelheden glycol, butanol, aceton & CZ
aan te maken + start massaproductie bakkersgist + biologische zuiveringsinstallaties rond
grote steden
• Niet verhinderd door vreemde micro-organismen (niet eigen aan prod)
DERDE PERIODE
Kennis & gebruik aseptische technieken (= om zaken steriel te doen) (niet makkelijk!) =>
zuivere culturen => farmaceutische prod penicillines
Farmaceutische prod: ALLES moet STERIEL zijn (= 0 micro-organismen aanwezig!)
(<-> andere biotech prod: steriliteit niet zo belangr vb waspoeder)
Sindsdien: metabolieten v tal v micro-org beschreven & geprod
Biologisch product: geïsoleerd uit levende organismen zonder (genetische) manipulatie
Biotechnologisch product: deel v biologisch prod manipulatie
Recombinante biotechnologisch product: biotech prod DNA manipulatie
VIERDE PERIODE
Start: invoer recombinant DNA-technieken & definiteive doorbraak v plantaardige &
dierlijke celculturen in productieprocessen (1970-1980)
Biotech = veel meer dan DNA-manipulaties
• Biotech <-> DNA-manipulaties: geen synoniemen !!
Farmaceutische sector: noodzaak aan massaprod v oraal werkzame antimicrobiële
stoffen => ontwikkeling v kiemverbetering & industriële aseptische technieken
• + introductie gebruik dierlijke celculturen in productieproces v vaccins
Recombinant DNA-technieken = genetic engineering
• = doorbraak in mogelijkheden farmaceutische nijverheid
DNA manipuleren + (stabiele) wijziging al dan niet in genoom v bepaalde cellen
(bacteriezoogdiercel)
• Recombinante proteïnen aanmaken op industriële schaal
• Lichaamseigen moleculen in grote hoeveelheden
▪ Zo: bepaalde:
• Neuro-endocriene boodschappers (FSH, LH, EGD, insuline,
erythropoietine, enkefaline,..),
• Lymfokines (communicatiemol tss cellen v afweermechanisme, vb
interferons, interleukines,…)
• Bloedproteïnen (stollingsfactoren, trombolytica,
proteaseinhibitoren)
▪ … kunnen wereldwijd klinisch getest w & therapeutisch gebruikt w
Ook recombinante technieken voor: vaccins, mAb (monoklonale anti-lichamen), enzymen
Gewone biologicals: bloed-afgeleide producten (biologische prod) (geen biotech prod)
Biotech producten: door manipulatie v micro-org, maar zonder wijzigingen DNA
Recombinant: DNA manipulatie, vb insuline
4
, Insuline:
• Normaal in lichaam: in beperkt # cellen gemaakt (alleen in beta-cellen pancreas)
• Gen vr coderen insuline: wel overal
▪ Genoom in hele lichaam zelfde, maar cellen doen versch dingen
▪ Uit-/aanzetten v promotoren (afh v omgevingsfactoren): bepaalt wat
cellen doen
• Startcodon codeert vr Methionine EW beginnen met Met
• Aanmaak insuline: EW start niet met Met
▪ Door post-translationele modificaties stuk v EW weg (signaalsequentie
afgeknipt)
• Varkensinsuline verschilt maar 1 AZ met menselijk
▪ Vroeger bij diabetes
▪ 1 AZ verschil = genoeg om als lichaamsvreemd EW herkend te w
• Patiënt maakt antilichamen aan tg varkensinsuline resistentie
werkt niet meer
Analyse vd nieuwe biogene GM’en = extreem belangrijk, kwaliteitscontrole (uitdaging)
• Risico op contaminatie (virussen,..)
▪ Strikte in procescontroles (strengere kwaliteitscontroles) + analyses
• EW’en = complexer dan klassieke GM
▪ Analyse veel moeilijker
▪ Moeilijkere prod’en om mee om te gaan
5
, mAb: monochromaal anti-lichaam
Structuur v opvouwen = moeilijk te bepalen + niet zo stabiel
GM’en in frigo/diepvries: gn denaturatie (= irreversibel !!)
• Als GM gedenatureerd is kan niet terug
6
,2 Basisbegrippen/technieken in biotechnologie & genetica
2.1 DNA-RNA
2.1.1 DNA-STRUCTUUR
Primaire struct: polynucleotide-struct
• Polynucleotide: door vorming 3’-5’-fosfordiëster verbinding tss nucleotiden
▪ Suiker-fosfaatskelet
▪ Basen op skelet gebonden via koolstof 1’ v suikermolecule (bepalen DNA-
sequentie)
Secundaire struct: 2 anti-parallelle ketens
• = Watson & Crick model
• Dubbelstrengig
▪ Uitz: vr enkele virussen met enkelstrengig DNA
• 1 streng in 5’3’ richtinhg, andere in 3’5’ richting (anti-
parallel)
• Ketens samengehouden door H-bruggen tss complementaire
basen (basepaarvorming): A-T & G-C
▪ Chargaffregel:
𝐴+𝐺 𝑝𝑢𝑟𝑖𝑛𝑒𝑠
= =1
𝐶+𝑇 𝑝𝑦𝑟𝑖𝑚𝑖𝑑𝑖𝑛𝑒𝑠
Veel virussen: enkelstrengig DNA-genoom
• Gebieden v complementariteit met zichzelf —> interne dubbel helix haarspeld
structuren
1 enkele streng bubbels: DNA blijft enkelstrengig omdat
intern opgeplooid niet intern complementair is (daar)
7
, Veel genomen = circulaire DNA moleculen
• Oa met meeste (/alle) bacteriële genomen, sommige virussen, versch
bacteriofagen & plasmiden
• In bacterie: al het DNA dat je er kan uithalen = circulaire DNA-moleculen
• Voordeel circulaire genomen:
▪ Om te kunnen delen: moeten eerst DNA kunnen verdubbelen
(2 dochtercellen)
▪ Bij circulair DNA: replicatieproces eenvoudiger
▪ <-> mens (zoogdieren): lineair DNA
• Plasmiden: maken niet per se deel uit v genoom!
▪ Kan zelfde bacterie hebben met/zonder plasmiden OF met versch
plasmiden
2.1.2 DENATURATIE – RENATURATIE
Denaturatie (eiwitten)
• Vb ei koken: vl vast
▪ EW’en verliezen originele struct
▪ irreversibel
Denaturatie (DNA)
• Reversibel !!!
▪ Kan renatureren (strengen weer samen)
▪ Kan je onbeperkt herhalen
• Invloeden denaturatie – renaturatie:
▪ Thermisch (verwarmen)
▪ pH wijziging (sterk Z/B)
➢ !! in te sterk Z/B milieu: DNA breekt af
▪ Destabilisatie met ureum, formamide
Tm waarde/ smelttemp (melting temperature)
• = temp waarbij ½ v basen in duplex ongepaard zijn ( ½ enkelstrengig)
• [G] [C] gehalte , Tm
▪ [G]-[C]: 3 H-bruggen ipv 2 bij [A]-[T]
➢ Betere binding stabielere binding moet meer E toevoegen om
te bteken
• Vnl belangr bij renaturatie afkoelen tot Tm waarde
▪ Als je voll gerenatureerd DNA wil: afkoelen tot ong 25°C onder Tm
Renaturatie:
• Gedenatureerde strengen die geïncubeerd w bij temp die ong 25°C onder Tm
waarde ligt gaan reassociëren
8
, Meting/detectie v denaturatie: door UV-spectrofotometrie
• Dubbelstrengig DNA: absorbeert minder UV bij 260 nm dan enkelstrengig DNA
denaturatieproces kan gevolgd w (want basen bij dubbel streng meer verborgen -
> kunnen minder licht absorberen)
Poly d(A-T)
• Enkel uit A & T (2 H-bruggen)
• Tot ong 60°C: A blijft zelfde verder: A (zonder iets toe te voegen) w
enkelstrengig
• Tm ong 70°C
▪ Op helft curve
▪ ½ enkelstrengig, ½ dubbelstrengig
DNA
• Tm ong 80°C
▪ Als je voll denaturatie wil: stuk boven 80°C
▪ Als je voll renaturatie wil: stuk onder 80°C
• Alle DNA uit org halen = gedenatureerd???
9
, UV-spectrometrie (Lambert-Beer)
• Schatting hoeveelheid DNA
• Schatting zuiverheid DNA
Hoeveelheid DNA:
• 1 OD260nm (OD = optimale densiteit)
▪ = +- 50 µg/ml dubbelstrengig DNA
▪ = +- 33 µg/ml enkelstrengig DNA
Zuiverheid DNA
• In zuivere DNA prepraties:
Verhouding OD260/OD280 = 1.8
VRAGEN:
1) stel verhouding = 1,5 (<1,8) DNA = onzuiver
2) stel verhouding = 2,2 (> 1,8) DNA = onzuiver
➔ zuiver DNA: verhouding = 1,8 (niet meer/minder) (niet “zeer zuiver”)
➔ als absorbantie groter/kleiner dan 1,8: door andere stoffen bij DNA die aborbantie-
spectrum beïnvloeden (verstoren verhouding)
3) stel verhouding = 1,8 weet niet zeker of DNA zuiver is !!
➔ kan nog andere stof in zitten met ong dezelfde verhouding v absorbantie
➔ OF 2 versch onzuiverheden ene absorbeert meer, andere minder verh = 1,8
10