Moleculaire biologie
HOOFDSTUK 1: DNA: deoxyribonucleic acid
1.1 Inleiding
Biochemische definities van leven
Afgescheiden: door celmembranen of celwanden
Energieopname en -verbruik: eten en drinken, energie door zonlicht
Groei: neemt toe in complexiteit tot het een volwassen stadium bereikt
Voortplanting: vermeerderen door (a)sexuele voortplanting
Beweging: zelfstandig bewegen, naar voedselbron/energiebron
Interpretatie van prikkels: gegevens uit zijn omgeving verzamelen en er op reageren
Communicatie: mbv moleculaire signalen
Biomoleculen:
Eiwitten
Suikers
Nucleinezuren
Lipiden
Waaruit bestaat een levende cel
eenheid van leven
Afgescheiden van omgeving
B.U.: georganiseerde opbouw door wisselwerking tss biomoluculen: proteïnen, lipiden,
carbohydraten, nucleïnezuren
Prokaryoten en eukaryoten, ons lichaam bevat iets meer prokaryote cellen dan eigen cellen
1.2 Mijlpalen uit de geschiedenis van de erfelijkheidsleer
Eigenschappen zijn erfelijk: de genen
Genen = info-bevattende elementen die de karakteristieken van een individu, maar ook van
de soort waartoe dit individu behoort, bevat. ( erfelijke eigenschappen)
Definitie van genen door Mendel : overerfbare kernmerken
o Experiment: Erwtenvariëteiten gekruist
o Besluit v. Mendel: 1) waarneembare eig tot overerfbare eenheden worden
teruggebracht 2) elke cel bevat 2 gekoppelde genen, waarbij meerdere allelen
mogelijk zijn 3) Dominant, recessief of intermediair
Link tss genen en biochemische processen door Garrod
Aandoening alkaptonurie en het overervingspatroon
o Urine die enige tijd aan lucht is blootgesteld kleurt zwart
o Recessief kenmerk ( defect gen)
o Urine heeft hoge concentraties homogentisinezuur => normaal afbraak door enzym
( = defect bij patiënten met die ziekte)
o Hij beschreef dus: een erfelijke veroorzaakte stofwisselingsziekte waarbij 1 defect
gen 1 defect enzym oplevert.
,Welke stoffen bevatten de genetische informatie?
Chromosomen zijn de dragers van de genen
Experimentele aanpakking:
1) componenten zuiveren: cel fractioneren in zijn verschillende componenten
2) Homogeniseren: verschillende componenten in oplossing komen
- sonicatie: eerst papje maken van weefsel en dan zoeken welke frequentie en lengte je
kan toepassen zodat DNA stuk gaat
- pers: opening kleiner dan cel waardoor ze stuk gaan
- detergenten: kan de lipiden oplossen (zit in de celwand) waardoor cellen openbarsten
- pestle: stamper
3) Centrifugatie: differentiële centrifugatie ofwel densiteitscentrifugatie
Principe van differentiële ( ultra) centrifugatie
= Men gaat op laag toerental centrifugeren, gevolg: 600x de valversnelling, zwaarste kernen gaan
beneden te komen liggen (pellet) en de rest blijft bovenaan (supernatans)
-> na vele hogere snelheden, kan je steeds kleinere dingen scheiden tot op het cytosol
Stap 1: cellen stuk gemaakt
Stap 2: homogenaat door filter gegoten om grote brokstukken te verwijderen
Stap 3: homogenaat met lage rotatie-snelheid gecentrifugeerd: de middelpuntvliegende kracht wordt
groter dan de zwaartekracht. Eerst worden de grote celorganellen naar de bodem van centrifugebuis
gedreven, dit wordt de pellet genoemd, het bovenstaande is het supernatans
Stap 4: deze pellet kan met terug in oplossing brengen in een nieuwe buffer. Het supernatans wordt
overgebracht naar ene nieuwe centrifugebuis en opnieuw gecentrifugeerd met hogere
rotatiesnelheid. Deze stap kan meerdere keren herhaald worden
Swinging bucket: proefbuis gaat horizontaal liggen door de snelheid
Principes van de densiteitscentrifugatie
Men maakt gebruik van het verschil in densiteit of dichtheid van de verschillende celorganellen f
moleculen in het cellysaat.
-> Eenvoudigste vorm:
Sucrose gradient: oplossing van sucrose in proefbuis, hoge sucrose gradient onderaan, lagen
met lagere sucrose gradient meer bovenaan
Homogenaat: molecules of organellen met hoge densiteit gaan meer onderaan komen te
liggen, zo heb je in elke laag een verschillende densiteit en verschillende soorten organellen
of moleculen in elke laag
-> Homogenaat gemaakt met CsCl gradiënt
, Mengsel met biomoleculen + CsCl aan 3000g laten draaien, Cs gaat centrifugale kracht
ondervinden en de hoge concentratie aan CS zal beneden zitten,
Organellen vestigen op de plaats met hun juiste densiteit => heel zuivere fracties bekomen
(zodat je C14 en C12 kan
onderscheiden)
Het experiment van Griffith (1941)
Experiment uitgevoerd met: twee stammen van bacterie Streptococcus pneumoniae
S- stam: hebben een gladde (smooth) vorm, veroorzaakt longontsteking bij muizen (uit deze stam de
R-stam ontwikkeld)
R-stam: hebben een rum (rough) vorm, veroorzaken geen longontsteking (niet virulent)
Griffith deed 2 experimenten:
- hij nam S-stamen maakte er homogenaat van, dit werd bij bacteriën van R stam gevoegd +
ingespoten in muis => muis ontwikkelde een longontsteking hoewel S bacteriën dood waren
=> bacteriën kunnen de dragers van eigenschappen (of genen) uit hun omgeving kunnen opnemen
- Welke stof in S-extract is hiervoor verantwoordelijk?
Homogenaat van S-stam gefractioneerd in: RNA, eiwitten, DNA,
vetten en koolwaterstoffen
Elk van deze fracties apart met de R-stam gemengd en bij de
muizen ingespoten.
Waarneming/besluit: de fractie DNA kon de R-stam
transformeren naar S-vorm
Besluit deel: met dit experiment werd voor het eerst aangetoond dat
erfelijke eigenschappen vervat zitten in het DNA
Het Hershey-Chase experiment ( 1952)
Men wist dat: na infectie met bacteriofagen er bacteriofaageiwitten ( of genen) tot expressie
komen in de bacteriën en dat bacteriofaag DNA wordt aangemaakt voordat de E.coli
openbarst en de nieuw gevormde bacteriofagen in het groeimedium terecht komen.
Een faagpartikel bestaat uit nucleïnezuurkern ingepakt in eiwitmantel (+ enkele ander
eiwitten die betrokken zijn bij infectie)
Bacterie E.coli + bacteriofagen samengevoegd gedurende 5min, dan wordt het gestopt door
hevig schudden zodat die loskomen van de bacterie. Hiernaa wordt het mengsel
gecentrifugeerd zodat bacteriën in pellet komen en bacteriofagen niet
=> E.coli gaat dood + maakt zelf bacteriofagen aan (hebben maar 5min nodig!)
Worden de overerfbare eigenschappen overgebracht door de eiwitten, of door het DNA van
de bacteriofagen?
Experiment:
o 1e Celcultuur: 32P toegevoegd aan E.coli en bacteriofagen, in gebouwd in DNA,
radioactief gelabeld
o 2e celcultuur: 35S toegevoegd aan E.coli en bacteriofagen incorporeert in eiwitten,
nakomelingen zijn gelabeld in een eiwit
o STAP 2: twee aparte culturen geïnfecteerd, hierna wordt hevig geschudt om het
contact tussen bateriofagen en bacteriën te verbreken. Door centrifugatie werde de
, E.coli verzameld als pellet op de bodem, terwijl bacteriofagen in het supernatans
blevenE. coli ( afzonderlijk) verzamelen
=> E.coli in pellet was in staat om nieuwe bacteriofagen te maken, coderende
component zit er al in. Is Dit DNA of eiwit?
o Waarneming: P zat in de pellet, in de bacteriën en S zat in de oplossing.
o Besluit: het DNA bevat de info over de bouwstenen van de bacteriofagen.
1.3 De structuur van het deoxyribonucleic acid (DNA)
DNA = suiker + fosfaat + basen
- DNA is Deoxyribonucleïnezuur. Nucleïnezuur komt voor
in twee vormen: DNA en RNA
- drager van erfelijkheid is DNA
- DNA bestaat uit lange polymeren
Suiker = deoxyribose(pentose afgeleid van beta-D-ribose)
Fosfaatgroepen gekoppeld aan 5’ uiteinde van het deoxyribose
Nucleobasen:
- purines: adenine + guanine
- pyrimidines: thymine + cytosine
Gekoppeld aan 1’ uiteinde van het deoxyribose, stikstof bevattende
ringstructuren
Nucleoside= nucleobase + een ribose
Specifieker: adenosine = adenine + ribose; guanosine= guanine+ ribose;
cytidine= cytosine + ribose; thymidine= thymine + ribose;
uridine= uracil+ ribose
Nucleotide= nucleoside + fosfaatgroep op 5’ uiteinde
o dNTP= deoxyribonucleoside-tri-fosfaten
o NTP = nucleotidetrifosfaten ( ribose is niet
gedeoxyleerd)
Ribosen met elkaar verbonden via fosfodiesterbindingen ( 5’,3’)
ATP (=adenosinetrifosfaat)
= drager van energie voor biochemische reacties in de cel
= nucleotide, het is een ribose, energie zit in fosfaat
Andere belangrijke basen en nucleotiden
