Samenvatting
samenvatting moleculaire biologie en DNA-technologie
- Instelling
- Hogeschool Gent (HoGent)
samenvatting moleculaire biologie en DNA-technologie 2de jaar, 1ste semester
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 41 pagina's
Voorbeeld 4 van de 41 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
Moleculaire biologie en DNA-technologieHoofdstuk 1: isolatie van nucleïnezuren
1. Structuur DNA
DNA bestaat uit:
2 antiparallelle strengen; gebonden door H-bruggen
Een 5’ uiteinde met een fosfaatgroep
Een 3’ uiteinde met een OH-groep
Bestaat uit 4 verschillende nucleïnezuren: A, G, T en C
2. Structuur RNA
= zelfde primaire structuur als DNA maar heeft een OH op 2’
Reactiever en minder stabiel dan DNA
RNA kan secundaire structuren vormen door lussen/loops te maken
(bv. Hairpin)
Waarom isolatie DNA nodig?
Enzymwerking wordt verstoord bij onzuiver DNA
Zuiver DNA nodig voor downstream
1. Lyseren (=stap 1); het openbreken van cellen om aan DNA te
kunnen
Methode is afhankelijk van het staaltype, er zijn meerdere soorten
weefsels en cellen die allemaal anders behandelt moeten worden
1.1 Mogelijkheden om cellen open te breken om DNA te isoleren
Chemische:
Detergent (SDS = vorming van micellen)
Alkalische buffer (NaOH)
Biologisch:
a.d.h.v enzymen; de meest voorkomende is Proteïnase K in de
humane cel
Proteïnase K Eigenschappen
= een enzym die eiwitten (in - Breed-spectrum
celmembraan en op - Knipt na hydrofobe
nucleïnezuren) en nucleasen groepen
afbreekt - Degradeert eiwitten
- Kan nucleasen
onschadelijk maken
- Verkiest 60° en pH = 7-9
,Toevoeging SDS(=detergent) of chaotrope stoffen = ze denatureren
het substraat waardoor het toegankelijker wordt voor het enzym =
activiteit
En lysozyme als enzym bij de bacteriën = hydrolyseert
peptidoglycaan
Gram positieve Gram negatieve
Dikke laag peptidoglycaan Een dunne laag peptidoglycaan
= kan makkelijker Met daarrond een extra
gehydrolyseert worden memebraan -> moeilijker te
hydrolyseren
Fysisch
Druk, temperatuur, straling
Mechanisch
Door beweging: vortexen of soniceren; met geluidsgolven
Combinatie van methodes
Bijvoorbeeld een lysebuffer = detergent en proteïnase K en een
chaotroop agens
1.2 Chaotroop agens
= (bv. SDS, ureum, fenol) verhoogt entropie in een biologisch
systeem door te interfereren met zwakken intermoleculaire krachten
zoals waterstofbruggen, vanderwaalskrachten, hydrofobe effecten=
neiging van niet polaire moleculen om samen te hangen en H2O uit
te sluiten
Functies op biomoleculen:
Verbreekt H20 mantel rond DNA
Denatureert eiwitten
Inactiveert nucleasen = bescherming DNA
Verhoogt membraanpermeabiliteit door verstoring hydrofoob
effect
(! Te kennen buffers = zie document op chamilo!)
1.3 Algemeen: hoe worden de cellen opengebroken in verschillende
organismen?
Humane cellen Bacteriën
Opengebroken door Opengebroken door NaOH
Proteïnase K + detergent + en warmte + lysozyme
warmte
, 2. Het zuiveren van het gelyseerde DNA (= stap 2)
Reden? Zuiver DNA kan beter deelnemen aan reacties
Cellysaat = de substantie verkregen na cellyse, bestaat uit:
DNA in waterige oplossing
RNA in waterige oplossing
Afbraakmaterialen van de cel
Detergenten, proteïnase K en chaotroop agens
Vroeger Nu
Fenol-chloroform extractie Kolomchromotografie of boom-
Gouden standaard extractie
maar schadelijke
producten
2.1 Fenol-chloroform extractie
Bestaat uit 3 fases
1. Waterige fase: met DNA; afzonderen + koude ethanol en
precipitatie -> pellet drogen en oplossen in neutrale
buffer
2. Interfase: met celdebris; eiwitten
3. Organische fase: met proteïnen en lipiden
De waterige fase wordt op het einde overgebracht in een
ander epje
Voordelen Nadelen
Zeer zuiver DNA Tijdrovend
Goede opbrengst Isopropanol precipitatie
Schadelijke organische
solventen
2.2 Boom extractie of kolomchromotografie
1. Lysaat wordt in een epje gedaan met een silicagel aan de
onderkant
2. Door centrifugeren blijft het DNA achter op de silicagel en de
andere contaminenten niet
Wordt gedaan met behulp van een bindingsbuffer (hoge zout
conc en chaotroop agens)
Functie
Verwijderen watermantel DNA en kolom
Vorming kationbrug tussen negatief DNA en silicakolom
3. De stoffen worden gewassen
, Wordt gedaan met ethanol en hoge zoutconcentratie + lage
pH + ethanol
=> DNA blijft aan kolom en contaminenten worden
weggewassen
4. Je verkrijgt een eluaat; door elutiebuffer: lage
zoutconcentratie en hoge pH
Voordelen Nadelen
Snel
Minder schadelijk
Zuiver en geconcentreerd
DNA
Makkelijk automatiseren
3. Het bewaren van het geïsoleerde DNA (=Stap 3)
3.1 Met een buffer
Dnase-vrij water
TE (Tris-EDTA) buffer
Voordeel: DNA langer stabiel
Nadeel: mogelijks storend voor downstream applicaties
3.2 Temperatuur
Normaal: -20°C
Bewaren voor lange periodes: -80°C
Bij herhaaldelijk in- en uitvriezen: 4°C, dit moet je proberen
vermijden want het lijdt tot vermindering van het DNA
3.3 Bewaren van startmateriaal
Je moet in- en uitvriezen vermijden van zodra het staal klaar is
3.4 Hoeveel startmateriaal?
Aan de hand van de grafiek kan je de maximale hoeveelheid van
startmateriaal afleiden
Te veel = je krijgt minder eindproduct
3.5 RNase tijdens extractie
Zorgt ervoor dat er geen RNA maar enkel DNA terecht komt in
het eluaat
(! Vragen slide 86!)
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper amber50. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €6,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 52510 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen