100% tevredenheidsgarantie Direct beschikbaar na je betaling Lees online óf als PDF Geen vaste maandelijkse kosten
logo-home
Eerder door jou gezocht
Eerder door jou gezocht
logo
Samenvatting - Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (U03D7A) €13,16
In winkelwagen
Snel navigeren naar
Voorbeeld
  2.  
  3. Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
  4.  
  5. Biomedische Wetenschappen
  6.  
  7. Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (U03D7A)

Samenvatting

Samenvatting - Methoden in het biomedisch onderzoek 2 (U03D7A)

1 beoordeling
 6 keer verkocht

Alle notities van de lessen en de slides zijn opgenomen in deze samenvatting, zelf een 16/20 gehaald. Alles staat erin, ook andere vrienden die de samenvatting gebruikt hebben zijn er altijd door geweest!

Laatste update van het document: 4 weken geleden

Voorbeeld 4 van de 134  pagina's

Document informatie

  • 4 mei 2024
  • 18 januari 2025
  • 134
  • 2022/2023
  • Samenvatting

Onderwerpen

Geschreven voor

Alle documenten voor dit vak (22)

1  beoordeling

review-writer-avatar

Door: tibbepeterskul • 4 weken geleden

de eerste hoofdstukken zijn gewoon de teksten op de powerpoint zonder extra commentaar bij hoofstuk 7 zijn de verschillende scanners wel goed uitgelegd

Verkoper

avatar-seller
emmameynaerts

Ontvangen beoordelingen

Voorbeeld van de inhoud

DNA vs. RNA
DNA = deoxyribonucleic acid

RNA = ribonucleic acid

1. DNA -> dubbelstrengig, RNA -> enkelstrengig
2. RNA is korter
3. DNA -> thymine, RNA -> uracil
4. DNA -> 3’OH uiteinde, RNA -> 2’OH uiteinde (zeer vatbaar voor RNasen)

Dideoxyribosen (ddNTPs) -> Sanger sequentie -> stoppen van ketenverlenging

Soorten RNA

mRNA, tRNA en rRNA; paradigma coderend RNA
(replicatie) DNA (transcriptie) -> RNA (translatie) -> proteïne

coderend en niet-coderend RNA
mRNA = coderend
tRNA en rRNA = niet-coderend

- mRNA = 1-4% van het totale RNA gewicht
- rRNA = 80-95% van het totale RNA gewicht
- short ncRNAs = <200 nucleotiden lang
- IncRNA = >200 nucleotiden lang
Structuur van mRNA

5’cap – (transcriptie start) - 5’UTR – start codon - coding region – stop codon - 3’UTR –
polyAstaart

Transcriptie start = promotor
5’cap = gemodificeerde guanine (methylgroep en dubbele fosfaatbrug)

1. DNA -> pre-mRNA (via transcriptie)
pre-mRNA = bevat 5’cap + introns + exons + polyAstaart
2. Pre-mRNA -> mRNA (via RNA processing = introns weghalen)
mRNA = bevat 5’ cap + exons + polyAstaart
3. mRNA -> polypeptide (via translatie)


RNA voorzorgen en bewaren
Voorzorgen bij staalname, werken met en bewaren van RNA

Problemen:

- RNA profiel -> veranderd na staalname (bv. inductie genen)
- RNA degradatie -> RNasen (endogeen en exogeen zijn)

1

, - DNA contaminatie -> scheiding van DNA/RNA = onvolledig



Staalname:

1. Anticoagulans kiezen: best EDTA -> heparine inhibeert DNA en RNA reacties
2. Stabiliseren van RNA: RNA degradatie/inductie voorkomen
onmiddellijk verwerken of invriezen in vloeibaar stikstof (-196°)
bloed RNA: vacuümtube met RNA bewaarmiddel (bv. PAXgene tube)
cellen/weefsels RNA: RNA bewaarmiddel (bv. RNAlater = ammoniumsulfaat oplossing
die eiwitten precipiteert -> verwijderen voor extractie, of Trizol = eerste stap van extractie)

DNA zal onveranderd blijven tijdens staalname = stabieler. DNA is gemakkelijk vrij van RNA
te maken door RNasen toe te voegen.

Staalverwerking

RNasen vrij werken!

- Zuiver werken
- Labojas en handschoenen -> bescherming stalen
- Labo/bench-zone voor RNA werk
- Oppervlakte en pipetten -> RNasen schoonmaakproduct (bv. RNasen ZAP)
- Filter pipettips
- Nuclease-vrije oplossingen en water
o Gefilterd water (milli-Q), RT-PCR grade water (getest op RNasen)
o Behandeling met RNasen inhibitoren
▪ DEPC (carcinogeen!) = reageert met amines in az (vnl. histidine) in de
katalytische site van RNasen en inhibeert deze. (Tris = amine; DEPC
werkt niet in Trisbuffer)
▪ Nieuwere RNasen inhibitoren zijn minder carcinogeen

Bewaring

- RNasen vrij water of TE-buffer 10/1, maar EDTA inhibeert RNasen niet: enkel DNasen
- Bewaring tot 1 jaar op -80° (< dan bewering DNA)
- Als alcoholprecipitaat > bewaring
- Meerdere aliquots staal in RNA bewaarmiddel voor latere RNA extractie beweren =
BETER

DNA contaminatie

- Niet altijd een probleem; als er onderscheid gemaakt wordt tussen DNA en RNA bij
een proef
- DETECTEREN;
o RT-min controle
o Elektroforese
- VERWIJDEREN; DNasen behandeling
o Toevoegen tijdens RNA extractie of behandeling van al geëxtraheerd RNA
o DNAsel ( knipt dsDNA en ssDNA) of dsDNA-specifieke DNasen
o NADEEL: verlies/degradatie van RNA is mogelijk



2

,RNA extractie is moeilijk DNA vrij te krijgen




RNA extraheren
Staal -> lyseren -> isoleren -> concentreren

Methode = afhankelijk van startmateriaal (weefsel, bloed, bacteriën en virussen)
en afhankelijk van het doel (hoeveel nodig, kwaliteit, …)

Essentiële stappen

1. Lyseren; weefsel/cellen afbreken zodat RNA vrijkomt, lysaat = vloeistof met inhoud van
gelyseerde cellen, goede homogenisatie belangrijk
2. Isoleren; RNA uit het lysaat halen en opzuiveren
3. Concentreren; RNA in het gewenste type en hoeveelheid vloeistof oplossen en
concentreren

Afbraak, lysis en homogenisatie van weefsels/cellen

- Verschillende methoden afh. van weefsel en celtype, volume en aantal stalen,
moleculen en toepassing.
- Remmers toegevoegd van niet-gewenste moleculen (DNasen en RNasen en
proteasen)
- Detergenten (bv. SDS, Trizol, guanidium chloride) = meest gebruikt
- Vriezen en ontdooien; lyseert i.t.t. cryopreservatie om cellen intact/leefbaar te
houden
- Mechanische homogenisatie; pletten in vloeibare stikstof (mortier en Pestel), bead-
gebaseerde homogenisator en schudden aan een hoge snelheid.
- Vloeibare homogenisator; Douncer = oplossing tussen glazen pestels
VOORDEEL = mild, laat celorganellen intact
- Sonicatie; gebruikt voor gewenste DNA fragmentatie
NADEEL = kan ook DNA/RNA fragmenteren

RNA extractie met organische solventen -> TRIZOL

Trizol = zuur PH 4-5 (guanidium thiocyanaat, fenol en chloroform)

- Guanidium thiocyanaat: cel lysis + RNase inhibitor
- VOORDEEL= goedkoop, eenvoudig, goede opbrengst en zuiverheid

Toevoegen -> goed mengen -> RNA is gescheiden van DNA en eiwitten -> waterlaag met RNA
overbrengen in een nieuwe tube -> gevolgd door alcoholprecipitatie of kolomchromatografie

Vergelijking met DNA extractie

DNA: phenol – chloroform PH7 voor DNA extractie
RNA: Trizol PH 4-5 voor RNA extractie

Verschil in PH en lading zorgt voor scheiding van DNA en RNA

RNA in de waterlaag
DNA in de waterlaag of organische laag/interfase

3

, 1. Alcoholprecipitatie
Uit supernatans
principe: DNA en RNA (PO3- groep) -> precipiteert in de aanwezigheid van zout + alcohol,
DNA + RNA lost terug op in water/buffer
Zouten: natriumacetaat
Alcoholen: ethanol of isopropanol
Bij lage concentraties en bij lage temperaturen! OF een drager toevoegen (glycogeen)
DNA fosfaatgroep is – geladen (hydrofiel), wanneer – lading geneutraliseerd wordt
door een + lading wordt dit hydrofoob.
Eiwitten slaan al neer met zout in een waterige oplossing voor DNA moet alcohol
toegevoegd worden.

2. Kolomchromatografie
Principe:
selectieve binding van RNA -> bepaalde condities van zout + pH (andere condities zetten
RNA terug vrij = elutie)
Vloeistof gaat door de silica kolom o.b.v.:
- Centrifuge
- Zwaartekracht
- Vacuüm
Verschillende type kolommen:

- VOORDEEL = eenvoudig en zeer goede zuiverheid
- NADEEL = duurder, opbrengst beperkt door capaciteit van de kolommetjes

Automatisering: magnetische beads met silica toevoegen, met magnetische beads uit
oplossing halen ; bedoeling = grote schaal, high-throughput en automatisering met
robots
vb. Covid-19 diagnostische testen

Silica kolom

- Buffer met chaotrope zouten (guanidium chloride)
o Lysis
o Nuclease inhibitie
o Chaotroop zout zorgt voor selectieve binding van RNA aan silica kolom
- Spin kolom = vloeistof door kolom sturen -> centrifugatie
- Elutie = losmaken -> water/buffer zet RNA terug vrij



RNA kwantificeren
Waarom? Inschatting opbrengst (welke hoeveelheid beschikbaar voor het experiment),
verschillende experimenten vragen een bepaalde concentratie/hoeveelheid RNA als input.
afwijkende concentraties/hoeveelheden kunnen HINDEREN:

- Te laag; weinig abundante targets indien er onvoldoende input is voor het
experiment.
- Te hoog; inhibitie of saturatie mogelijk, meer is niet altijd beter


4

Dit zijn jouw voordelen als je samenvattingen koopt bij Stuvia:

Bewezen kwaliteit door reviews

Bewezen kwaliteit door reviews

Studenten hebben al meer dan 850.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet jij zeker dat je de beste keuze maakt!

In een paar klikken geregeld

In een paar klikken geregeld

Geen gedoe — betaal gewoon eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard en je bent klaar. Geen abonnement nodig.

Focus op de essentie

Focus op de essentie

Studenten maken samenvattingen voor studenten. Dat betekent: actuele inhoud waar jij écht wat aan hebt. Geen overbodige details!

Veelgestelde vragen

Wat krijg ik als ik dit document koop?

Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.

Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?

Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.

Van wie koop ik deze samenvatting?

Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper emmameynaerts. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.

Zit ik meteen vast aan een abonnement?

Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €13,16. Je zit daarna nergens aan vast.

Is Stuvia te vertrouwen?

4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)

Afgelopen 30 dagen zijn er 69052 samenvattingen verkocht

Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen

Start met verkopen
€13,16  6x  verkocht
  • (1)
In winkelwagen
Toegevoegd