Samenvatting
Samenvatting Gentechnologie I deel II, BCBT
- Vak
- Gentechnologie I
- Instelling
- Universiteit Gent (UGent)
samenvatting van 2de deel van gentechnologie deel II door prof. berckx (voor goedkopere prijs stuur via messenger)
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 47 pagina's
Voorbeeld 4 van de 47 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
SAMENVATTINGGENTECHNOLOGIE I:
DEEL II
[Ondertitel van document]
Abstract
[Trek de aandacht van uw lezer met een interessante samenvatting. Dit is
meestal een kort overzicht van het document.
Wanneer u uw inhoud wilt toevoegen, klikt u hier en begint u te typen.]
Jarne Winderickx
[E-mailadres]
,INHOUD
1. VECTOREN.................................................................................................3
1.1 INLEIDING..................................................................................................................... 3
1.1.1 Bereiding van het te kloneren DNA.....................................................................3
1.1.2 Invoeren van het DNA fragment in gekozen vector............................................3
1.1.3 Inbrengen in de gastheer (GH)...........................................................................3
1.2 VECTOREN.................................................................................................................... 4
1.2.1 Plasmiden........................................................................................................... 4
1.2.1.1 Het plasmide ColE1 als modelsysteem voor de latere ontwikkeling van
kloneringsvectoren................................................................................................................. 4
1.2.1.2 Plasmiden als kloneringsvectoren............................................................................... 5
1.2.1.3 Voorbeelden............................................................................................................... 5
1.2.1.4 Plasmide transformatie in bacteriën........................................................................... 6
Chemische behandeling..................................................................................................... 6
Electroporatie..................................................................................................................... 6
1.2.2 Enkelstrengige DNA bacteriofagen.....................................................................7
1.2.3 Faagmiden.......................................................................................................... 7
1.2.4 Faagvectoren afgeleid van bacteriofaag.............................................................7
1.2.5 Cosmiden............................................................................................................ 9
1.2.8 Intermezzo: verkorten van gDNA......................................................................10
1.2.9 Supervectoren: YACs en BACs...........................................................................10
1.2.10 Keuze van de vector.......................................................................................11
1.2.10.1 Expressievectoren.................................................................................................. 11
1.2.10.2 Constructie van een genomische bank...................................................................11
1.3 NIEUWE GENERATIE KLONERINGSMETHODEN.......................................................................11
1.3.1 Klassieke klonering........................................................................................... 11
1.3.2 TOPO klonering: moderne kloneringen.............................................................12
1.3.2.1 TOPO TA klonering.................................................................................................... 12
1.3.2.2 Zero blund TOPO klonering....................................................................................... 12
1.3.3 Gateway klonering............................................................................................12
1.3.4 Creator klonering.............................................................................................. 14
1.4 OEFENING: NAADLOOS KLONEREN EN GENFUSIE..................................................................14
2. DNA LABELEN........................................................................................... 15
2.1 RADIOACTIEVE MERKERS................................................................................................ 15
2.1.1 Detectie............................................................................................................ 16
2.2 NIET-RADIOACTIEVE MERKERS......................................................................................... 17
2.3 ENZYMATISCHE METHODES VOOR NUCLEÏNEZUUR LABELEN....................................................18
2.3.1 5’-eindstandige merking...................................................................................18
2.3.2 3’-eindstandige merking...................................................................................18
2.3.3 Inwendige merking...........................................................................................18
2.3.4 Merking RNA moleculen....................................................................................19
2.4 CHEMISCHE SYNTHESE VAN NUCLEÏNEZUREN / PRIMERS / OLIGONUCLEOTIDEN...........................19
2.5 CHEMISCHE OF FOTOMERKING VAN NUCLEÏNEZUREN............................................................20
3. TRANSFORMATIE VAN BACTERIËN EN SELECTIE VAN TRANSFORMANTEN......20
3.1 TRANSFORMATIE........................................................................................................... 21
3.2 SELECTIE MET BEHULP VAN SELECTIE-MERKERS...................................................................21
3.3 TRANSFORMATIE-EFFICIËNTIE.......................................................................................... 21
3.4 KOLONIEHYBRIDISATIE................................................................................................... 21
4. DNA SEQUENERINGS METHODES................................................................22
4.1 SANGER METHODE / DIDEOXY SEQUENERING......................................................................22
4.2 SEMI-AUTOMATED SEQUENERING.....................................................................................22
4.3 SEQUENEREN VAN COMPLETE GENOMEN: SHOTGUN SEQUENERING.........................................23
1
, 4.4 CAPILLAIRE ELEKTROFORESE........................................................................................... 24
4.5 BLAST / BASIC LOCAL ALIGNMENT SEARCH TOOL: OVERSLAAN..............................................25
4.6 NEXT GENERATION SEQUENCING / NTG SEQUENCING..........................................................25
4.6.1 Pyrosequencing................................................................................................26
4.6.2 Illumina sequencing..........................................................................................27
4.6.3 SOLID sequencing / sequencing by oligoligation and detection........................28
4.6.4 Enkelvoudige DNA molc sequenering / Helicos sequenering.............................29
4.6.5 SMRT sequenering............................................................................................30
4.6.6 Isolatie DNA van interesse................................................................................30
4.6.7 ChIP sequencing...............................................................................................31
4.6.8 Ion Torrent sequencing.....................................................................................31
5. GENEXPRESSIE.........................................................................................32
5.1 HETEROLOGE / RECOMBINANTE GENEXPRESSIE IN PROKARYOTEN............................................32
5.1.1 Induceerbare promotor voor genexpressie.......................................................32
5.1.1.1 Trp operon................................................................................................................ 33
5.1.1.2 Lac-operon............................................................................................................... 33
5.1.1.3 Tac-promotor: hybride Trp en lac promotor...............................................................34
5.1.1.4 pL promotor.............................................................................................................. 34
5.1.1.5 T7 gen 10 promotor.................................................................................................. 34
5.1.1.6 Regeling ProU operon / osmoregulatie......................................................................35
5.1.1.7 Laboschaal vs industrieel......................................................................................... 35
5.1.2 Fusie-eiwitten................................................................................................... 36
5.1.3 Faag-display..................................................................................................... 36
5.1.3.1 faag-display van AL-fragmenten............................................................................... 37
5.1.3.2 VHH AL / nanobodies / Heavy-chain only AL.............................................................40
5.1.4 Controle eiwitsynthese.....................................................................................40
5.1.4.1 Codon gebruik: aanpassen aan organisme...............................................................40
5.1.4.2 N-terminale AZ bepalen eiwitstabiliteit mee.............................................................40
5.1.4.3 Eiwitopvouwing bevorderen: S-S brug vorming.........................................................41
5.1.5 Verwijderen van ABR-genen..............................................................................41
5.2 VOORBEELDEN VAN RECOMBINANTE THERAPEUTISCHE EIWITTEN.............................................42
5.2.1 mens IFN-beta klonering en expressie..............................................................42
5.2.2 menselijk groeihormoon / MGH klonering.........................................................43
5.2.3 Biologische inperking van genetisch veranderde L. lactis.................................44
5.2.4 Recombinant influenzavaccin aangemaakt in E.coli.........................................45
2
, 1. VECTOREN
1.1 INLEIDING
Kloneren = invoeren DNA segment (uit bacterie, plant, dier,…) in geschikte
dragermolecule / vector om daarna stabiel te doen vermenigvuldigen in
gekozen GH
o Vector bepaald door GH + moet kunnen worden doorgegeven aan
volgende generaties
Stappen kloneringen: bereiden DNA-fragment invoeren in vector
inbrengen in GH zoeken naar GH die vector hebben opgenomen (/
positieve klonen) amplificeren
o Hoe amplificeren? klonaal uitgroeien (= alle bacteriën op
agarplaat doen groeien verdunnen isolatie 1 kolonie
monocultuur
1.1.1 BEREIDING VAN HET TE KLONEREN DNA
= nieuw DNA (PCR-product, DNA-fragmenten na restrictiedigest,…) als in
vivo geïsoleerd DNA (gDNA / genomisch DNA)
Ook onderscheid: klonering 1 enkel fragment of gehele mengsels
fragmenten
o Gehele mengsels: om cDNA en gDNA banken te maken
Hoe? cDNA’s van alle voorkomende mRNA in cel kloneren
1.1.2 INVOEREN VAN HET DNA FRAGMENT IN GEKOZEN VECTOR
Oorspronkelijk: ligatiereactie tussen insert + vector (= klassieke
klonering)
1.1.3 INBRENGEN IN DE GASTHEER (GH)
Transformatie vs transfectie: vreemd DNA binnenbrengen in virussen,
bacteriën,.. vs vreemd DNA binnenbrengen in eukaryote cellen
3
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper jarnewinderickx. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €3,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 53340 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen