DEEL 1 - INLEIDING
1. Virus vaccins
- Pokken
- Polio
o kinderverlamming, indien middenrif aangetast → ijzeren long machines: onder en
overduk creeren: hoofd ligt erbuiten
o bijna weg (alle continenten behalve Azië; streek tussen afganistan en pakistan: enkele
gevallen jaarlijks, 2/3 varianten al uitgeroeid en we verwachten ieder jaar van volledig)
2. Virus structuur
- grootte: zeer klein (25 a 300 nm) → enkel via elektronenmicroscoop (Titan Krios cryo-electron
microscope), ultrafiltreerbaar (filter die bacterie wel tegenhoudt)
- Envelop oftewel naakt
o Lipiden dubbellaag: < menselijke celwand gestolen, als het zich in mens vermenigvuldigt
- Capside: eiwitlaag rond genoom
Structuur
o Helicaal: basis, simpel, 1 eiwit als dakpannetjes rond genetisch materiaal
(bescherming), energetisch zeker economisch, bijv. tabaksmozaiekvirus,
ebolavirus
o Icosahedraal: heel sterk, zeshoek + vijfhoek (om bolvormige structuur te
kunnen maken), bijv. adenovirus, herpesvirus, papillomavirus
o Complex: geen van bovenstaande, bijv. T-bacteriofaag, pokkenvirus
- Genoom
o DNA of RNA (andere levende organismen hebben beide)
o Dubbelstrengig (ds, vaak DNA) of enkelstrengig (ss, meestal RNA)
o Lineair of circulair
o 1 stuk of segmentair (bijv. rota, griep (8 segementen))
§ Opm: gevolg segmentair: reassortment wanneer 2 verschillende
virussen vermengen in cel, genetische shift (↔ genetische drift: traag)
o Voorbeelden:
3. Virus taxonomie en nomenclatuur
Door ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses)
Indeling o.b.v.:
· Eigenschappen van het virion (grootte, vorm, envelop, capsidestructuur, …)
· Fysicochemische eigenschappen (MW, genoomeigenschappen, G+C ratio, NT-sequentie, …)
· Virale eiwitten (aantal, grootte, functie, AZ-sequentie, …)
· Viraal genoom en lifecycle (genoomorganisatie en -replicatie, plaats van virion assemblage,
maturatie, release, …)
· Biologische eigenschappen (natuurlijke gastheer, weefseltropisme, (histo-)pathologie,
transmissie, geografische distributie, …)
(orde (-virales) > familie (-viridae) > subfamilie (-virinae) > genus (-virus) > naam)
1
,4. Replicatie
Celafhankelijk
Virale replicatiecyclus:
1. Binding aan cellulaire receptor
o Evt. via spikes, coreceptor
o Meerdere sleutels op meerdere sloten
2. Binnendringen in doelwitcel (verschillende strategieën):
opm: enveloppe niet statisch
o geënvelopeerd virus: fusie met plasmamembraan of endocytose
o niet-geënvelopeerd virus: endocytose
o bacteriofaag: injecteren viraal genoom
3. Ontmanteling van het virus: openen capside, vaak spontaan (vaak door
verandering in pH)
4. Synthese ‘vroege’ E-eiwitten: maken vermenigvuldiging mogelijk; soms met eigen replicasen en
polymerase (slechte kwaliteit → mutatie → evolutie) soms die van de eukaryoot gebruiken
(weinig fouten)
5. Viraal DNA/RNA replicatie
6. Synthese ‘late’ L-eiwitten
7. Assemblage nieuwe virions
8. Vrijzetting nieuwe virions:
o Drastisch: cytolyse: virussen blijven bijfabriceren tot cel doodgaat of openbarst
o Vriendelijk: budding: aanleunen tegen celwand en met wand afsplitsen
2
,DEEL 2: DIAGNOSTIEK
1. Rechtsreeks: aantonen van virus
1.1. Elektronenmicroscopie
Voor specialisten
1. Vloeibaar staal opbrengen
2. Kleuring
3. Kijken door microscoop: direct diagnose
Immuno-elektronenmicroscopie
- Indicatie: wanneer virale load laag is
- Mechanisme: toevoegen AL tegen virus dat je zoekt (moet je dus wel al weten) → klontervorming
- Voordeel snelle diagnose, nadeel getraind personeel, duur toestel en onderhoud
1.2. Virale kweek op celcultuur
Vroeger the way to go, nu minder belangrijk
in dieren kweken:
o voorbijgestreefd
o virus inspuiten in allantoidale ruimte (ei) → kan zich daar vermenigvudigen en dan daar
terug uithalen toep: influenzavaccins worden nog steeds zo gemaakt
in celculturen kweken:
- Soorten
o PRIMAIRE CELLEN
monkey kidney cellen: beste cellen daarvoor (vroeger)
§ versnijden → vloeibaar medium → machine → incuberen 7 dagen →
contactinhibitie → trypsinisatie: breken verbindingen tussen cellen → cellen
komen los van drager → verdunnen
• opm: kankercellen ontstnappen aan contact inhibitie
Ø 1-2 splitsingen (dan afsterven, niet geweten waarom)
o SEMI-CONTINUE CELLEN
human embryonic kidney, fibroblasten
Ø 50 splitsingen
o CONTINUE CELLIJN
Kankercellijnen: HeLa, Vero, Hep2
Ø oneindig aantal splitsingen
- Kenmerken:
- incubator: 37°C
- medium met pH indicator (CO2 te hoog = te basisch = roos), groeifactoren (stalen rond
draaien om te mengen)
- microcarrier
- werkbank: (!)
o horizontale laminar flow - clean air werkbank: besmetting
van jezelf
o klasse I microbiologische veiligheidswerkbank: kan wel met
gevaarlijk materiaal, Gefilterd door hepafilter
o klasse II microbiologische veiligheidswerkbank: nog beter,
luchtgordijn, veilig voor met gewone virussen
o klasse III microbiologische veiligheidswerkbank: vaste
handschoenen (niet eenvoudig), voor meest gevaarlijke virussen
1
, - Cytopathogeen effect (CPE): wat virus doet met cel
o PLAQUE (CELLYSIS): nestelen in cellen en geven door → geinfecteerde cellen
gaan stuk → plaque/opklaring
§ Virustitratie (verdunnen): vanaf welke verdunning volledige
celdood
o KERN INCLUSIES: heel grote kern (weinig cytoplasma) en ophopingen in
kern
o CYTOPLASMA INCLUSIES: opstapeling viruseiwitten (gaan kern induwen)
o REUSCELLEN/SYNCYTIA: versmelten cellen
§ Cytofagocytose: cel wordt opgegeten door andere, leidt tot
meerkernig
o cave: artefacten (zie foto’s op dia’s)
§ niet confluente celcultuur (nog niet voltooid): lijkt op plaques
§ mitose figuren (als celcultuur nog aan het delen is): lijkt op
intranucleaire inclusies
§ kleurstofinclusies: lijkt op intracytoplasmatische inclusies
- niet-CPE methoden: cellen met virus besmet maar er niet kapot aan gaan en dus
niet zichtbaar
o hemadsorptie: infectie cel met virus dat hemaglutinine op oppervlakte
heeft → komt tot expressie op celmembraan → RBC blijven zitten aan
oppervlak cel na toevoegen RBC
o immunofluorescentie: fluorescent gemerkte AL tegen (gekend) virus
1.3. Antigeendetectie
• IMMUNOFLUORESCENTIE: in cytoplasma antigenen virus aantonen
• IMMUNOCHROMATOGRAFIE: virus omhoog gezogen en als het bandje tegen komt
met antigenen geeft dat een lijntje (~ sneltesten covid) VS
• HEMAGGLUTINATIE: als virussen hemaglutinine op oppervlak hebben
• ELISA: AL-AG reactie laten blijken
Positief Negatief
1.4. Genoomdetectie
Meest gebruikt
• IN SITU HYBRIDISATIE
• KWALITATIEVE TESTEN
- PCR: revolutionair, door heel veel cycli van denaturatie, annealing en elongatie
o Vroeger: 3 waterbaden, 1 voor elke fase, telkens na 1 minuut verbaden
o Tegenwoordig: geautomatiseerd
• KWANTITATIEVE TESTEN: geven enkel aan besmet of niet
- Fluorogenic 5’ nuclease assay → kwantitatieve PCR:
fluorescentie wordt groter tot tresshold over is, hoe lager
tresshold cycle hoe meer viruspartikels
• GENOTYPERING: exacte sequentie vinden
- Vroeger: Sanger: 2 glasplaten en hele dunne gel ertussen met gaatjes → vloeistof gieten
→ gel overbrengen op filterpapier → radialuscentie → A/T/G/C aflezen (duur: half jaar)
- Later: capillair elektroforese (niet meer met gels)
o Zo eerste gesequeneerde virus bacteriofaag MS2 (‘76), bacterie H. influenzae
(’95), gist S. cerevisiae (’96), worm C. elegans (’98), plant A. thaliana (‘00), homo
sapiens (’01)
- Tegenwoordig: next generation sequencing, duurt een voormiddag, continu, klein
machientje
2
