Dit document omvat de samenvatting (info slides + lesnotities) van les 1 van het vak 'genome technology and applications'. Les 4 was gewoon een inleiding van NGS voor de taak. Hierbij moet je in groep een presentatie geven over een bepaalde NGS techniek.
General info
- 4 professors
- Seminar on Next Genera3on Sequencing
o Prepara3on and a:endance is compulsory
o In small groups
o Prepare a small 10 minute presenta3on on a certain topic related to NGS
o Different topics foreseen
o Follow-up seminar with discussion
- Slides on BB
Cell-based DNA cloning
Principles of DNA cloning
- Developed in the 1970s
- Used a lot and also today
- 4 steps
- Early: cloning was used to amplify DNA. There was no PCR un3l the late 80s
1. In vitro construc.on of a recombinant DNA molecule
- Requires cuRng and pas3ng of DNA
o Restric3on endonucleases (cuRng)
o DNA ligase (pas3ng)
- Requires a replicon (= piece of DNA that makes independent replica3on possible )
o A piece of DNA that makes independent DNA replica3on possible
o Replicon is specific for a host
o Usually a construct called “vector” is used, containing many features used in the cloning
process.
§ A vector: usually a plasmid, but has engineered -> specific features that makes it
suitable
2. Transforma.on in a host (o<en a bacteria -> will replicate the DNA)
- Recombinant DNA molecule is introduced in a host cell
- Usually bacterium or yeast
o Easy to grown
o Fast reproduc3on
- For expression studies, cloning is o]en done in eukaryo3c cells (mammalian cells, insect cells,
see later in this chapter)
o For some research this is important. You bring your recombinant molecule in the
mammalian cells and you can study the cells.
- For expression studies, cloning in a bacterium usually precedes cloning in the host used for
the expression
o Cloning in bacteria will always need to be done. Before puRng the construct in the
mammalian cells you will make the construct in bacteria -> the finished product will be
cloned in mammalian cells
, 3. Selec.ve propaga.on of clones
- Cells are plated on agar
- Each individual cell forms a colony
- Each colony is a clone:
o All cells are iden3cal, and have the same ancestor cell
- 1 colony can be grown in liquid medium to obtain more cells
- A]er the transforma3on you can bring the bacteria on agar -> grown and form colony (all
cells in the colony are iden3cal). You can take one colony and growth it in liquid media
4. Isola.on of recombinant DNA clones
- The recombinant DNA is purified from the cells
- You can take out the construct a]er cloning
o You take one colony -> you put in a liquid medium -> growing it overnight at 37°C -> lyse
and purify
Further into it
1. Restric.on endonucleases
- CuRng
- Nomenclature: 1 le:er genus, 2 le:ers species, followed by number
o E.g. HaeIII: Hemophilus aegyp3cus
- We get our restric3on enzymes from bacteria
o Natural defence mechanism against bacteriophages
o DNA from bacteriophage enters the bacterium then it is cleaved
o There is a matching sequence specific DNA methylase
§ Methyla3on of the same recogni3on sequence
§ Bacterial DNA cannot be cut
è Restric3on endonucleases recognizes a specific DNA sequence -> will only cut that
sequence. It will methylate its own DNA and it will make the restric3on endonucleases that
way that its own DNA is not cut
o Type II RE will cut a specific recogni3on sequence
o Usually 4-8 bp
o Usually palindrome
- Cleavage
o On the symmetry axis: blunt ends
o Not on the symmetry axis : overhangs, s3cky ends, cohesive termini
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper evagoormans. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €7,16. Je zit daarna nergens aan vast.
