Samenvatting omvat alle hoofdstukken van het vak "Advanced Protein technology and proteome analysis", gegeven door professor Van Ostade en professor Boonen. De cursus wordt gegeven in 1ste master Moleculaire Mechanismen van Ziekten en behandelt diepgaand de technieken en toepassingen binnen de eiw...
Bottom-up
De meest gebruikte techniek bij proteomics is bottom-up:
eiwitten worden geknipt in kleinere peptiden om deze
peptiden te identificeren op basis van hun fragmentatie
spectrum. Eiwitten kunnen intact zijn maar dit is significant
moeilijker omdat de interpretatie van eiwit fragmentatie
spectra moeilijk is.
1.0.2 VERLOOP VAN PROTEOMICS
1.0.3 SHOTGUN PROTEOMICS
Shotgun proteomics
● Start van cellen → eiwitextractie → complex proteïne staal → tryptic digest → complex peptide staal →
peptide scheiding via LC → minder complex peptide staal → verzamel zoveel mogelijk fragmentatie spectra
van een monster en identificeer ze → MS software selecteert peptiden voor fragmentatie gebaseerd op wat
is gedetecteerd in MS1 = data dependent acquisition (DDA)
→ Shotgun is meestal bottom-up.
,Shotgun proteomics is zoals genome sequencing MAAR
● Er is geen amplificatie stap → dynamische range is gelimiteerd
● Meestal niet mogelijk om een complete eiwitsequentie te krijgen van complexe stalen
○ Dit is al een uitdaging bij gezuiverde eiwitten, omdat sommige peptiden misschien moeilijk te
meten zijn (vanwege ionisatie verschillen).
● Protein interferentie probleem
● Complexiteit neemt toe van DNA → RNA → eiwitten
1.0.4 TOEPASSINGEN
Massaspectrometrie-gebaseerde technieken worden momenteel veel gebruikt voor het beantwoorden van
verschillende vragen in proteomics (we zijn meestal niet geïnteresseerd in het sequencen van eiwitten).
➔ Toepassingen van proteomics in de biowetenschappen
➔ Vergelijken van protein profielen gezondheid/ziekte
➔ Wat is de concentratie van een eiwit in een sample (biomarker)?
➔ Is het PTM-profiel (post-translationele modificatie) anders bij gezondheid/ziekte?
➔ Welke proteïnen interacteren met elkaar in de cel?
➔ Spatiale locatie van proteïnen
➔ Wat is het effect van een SNP op proteoforms?
➔ …
Op basis van wat je wilt onderzoeken, moet je andere sample preparation doen.
,1.1 SAMPLE PREPARATION
Doel les
In deze cursus maak je kennis met protocollen voor sample prep in de praktijk.
De doelen van deze cursus zijn
● Je vertrouwd maken met de protocollen zodat je deze herkent bij het lezen van werkstukken
● De trends in monstervoorbereiding uitleggen
● Enkele voorbeelden geven van meer geavanceerde onderzoeksvragen en hoe deze worden opgelost.
● Je hoeft de exacte protocollen niet uit je hoofd te leren! Het is belangrijk om het idee erachter te begrijpen
→ enkel algemene stappen kennen voor het examen
→ verder vermelde protocollen niet vanbuiten kennen
→ waarom wijken huidige protocollen af van standaardprotocol? Geef 1 voorbeeld.
- Bv. eiwitten zijn minder stabiel dan nucleotiden
- Temperatuur, pH anders, …
1.1.1 ALGEMENE STAPPEN
Algemene stappen in sample preparation
1. Wetenschappelijke vraag - experimenteel ontwerp : definiëren wat je wil doen/wat probleem is
2. Literatuurstudie : is er al iets gelijkaardigs gebeurd?
3. sample collection: liefst verse stalen die zo snel mogelijk gestabiliseerd zijn
4. Proteïne extractie- oplosbaar maken
5. Proteïne scheiding of -zuivering (optie)
6. Reductie en alkylering
7. Digestie
8. Peptiden zuivering of -selectie
9. Prefractionering (optie)
➔ Definieer je onderzoeksvraag
➔ Kies je protocol op basis van stap 1, er zijn veel verschillende protocollen voor specifieke doeleinden
➔ Zorg ervoor dat de samples die je gebruikt van de hoogst mogelijke kwaliteit zijn en voorkom afbraak
voorkomen (protease- en fosfatase remmers)
Belangrijke opmerking!
Belangrijk om contaminatie te vermijden: lage hoeveelheden eiwitten kunnen meten, maar door contaminatie gaat
dit moeilijk worden → MS zeer gevoelig voor deze contaminatie
1. Maak altijd verse buffers
1. Gebruik oplosmiddelen en buffers van LC-MS kwaliteit.
2. Pipetteer nooit direct vanuit een stockoplossing of oplosmiddel, gebruik een bekerglas
Veel voorkomende contaminanten : plasticizers ((zoals polyethyleenglycol, PEG) en keratine)
,KLEINERE STALEN
1 van de redenen dat protocollen verandert zijn = kleinere stalen
● Staal volume kan beperkt zijn (bv. tumor biopsies)
● Single cell data is nodig (bv. tumoren zijn heel heterogeen) → gevoelig kunnen meten op single cell niveau
● Zeer gevoelige technieken kunnen snel gesatureerd zijn bij grotere stalen en zo de dynamische range
verkleinen. Meer startmateriaal gebruiken is niet altijd een voordeel.
Nadelen van kleine stalen
● In een cel : eiwitconcentraties variëren
● Kleine stalen gaan snel verloren doordat eiwitten binden aan oppervlakken (buisjes, pipetpunten),
switching valves en de stationaire fase van de LC.
● Kleine volumes zijn nodig om de concentratie te verhogen en zo de detectielimiet te verlagen.
→ In het algemeen wijkt de proteomics sample prep in artikelen daarom af van de "basics" om bovenstaande
problemen te minimaliseren
Oplossing
Om deze problemen op te lossen moet men zo gevoelig mogelijk meten:
● Zo weinig mogelijk het staal transporteren: van 1 epje naar het andere (examples 1-4)
● Volume zo klein mogelijk houden (5-8)
● Opp satureren zodat staal er niet meer aan kan plakken met (e.g. with albumin or
n-dodecyl-𝛽-D-maltoside)
Automatiseren
Automatisering en standaardisatie zijn vereist bij het gebruik van grote aantallen samples→ dus miniaturisatie en
robotisering zijn beide gewenst
COMBINEREN VAN TECHNIEKEN
Verschillende vormen van proteomics zorgen ook voor variatie in protocollen
● Proteogenomics
● Phosphoproteomics
● Interactomics
● …
FASP: filter aided sample prep
Doel : staal verlies minimaliseren → gaan werken met kleinere volumes dmv MW cut-off filter: peptiden kunnen
hierdoor maar eiwitten niet
Principe
● Filter heeft cut-off waarde van <3 kDa
● Alles groter dan 3 kDa kan er niet door
● Eiwitten worden tegengehouden op filter
● Contaminanten verwijderen van filter door
gebruik van detergenten en wasstappen
FASP is compatibel met hoge hoeveelheden SDS (voor lysis) door verwijdering van SDS in oplossing na lysis (goed
omdat het membraaneiwitten bevat!)
Nadeel: ureum decomposes to cyaanzuur, dat reageert met zijketens van lysine en arginine en
N-terminal aminogroepen om gecarbamyleerde residuen te vormen
Nog gevoeliger : microFASP met opp van 0,1 mm²
1.2.2 SHOTGUN PROTEOMICS 2: PARAMAGNETIC BEADS
Paramagnetic beads principe (SP3)
● Carboxylaat-gecoate paramagnetische beads in staal brengen (-COOH)
● Eiwitten en peptide binden het hydrofiele oppervlak wanneer een organisch (hydrofoob) oplosmiddel
wordt toegevoegd (acetonitril, MeOH)
● Aan zijkant hou je magneet → buffer kan je wegpipeteren
● De korrels met gebonden eiwitten zullen dus nooit de buis verlaten! → gebruik van 1 epje
● Detergenten en andere LC-MS niet-compatibele reagentia lossen op in de organische fase en worden dus
gemakkelijk verwijderd
C18 stagetips : normaal gebruikt voor de solid phase extractie waarbij peptiden worden opgezuiverd
Protocol vermijd sterke detergenten omdat er anders verlies van staal is en/of introductie van contaminatie
● Lysis buffer: TCEP (tris-2-carboxyethyl phosphine) en CAA (chloroacetamide) kunnen gebruikt worden =
zowel reductie en alkylatie te samen! = specifiek voor dit protocol
Protocol
● Na sonificatie, verwarmen en digestie met trypsine wordt het staal door een C18 coated tip gelopen
● Peptiden blijven plakken op C18 beats terwijl contaminanten niet binden.
● Elutie van de peptiden gebeurd via solid phase extractie
➔ Kan in 96-well! formaat doen = snel en alle reacties tegelijk HA
➔ Zeer snel, alle reacties in hetzelfde kleine volume dus minimaal
sample verlies
➔ Niet voor membrane proteomics
1.2.4 SHOTGUN PROTEOMICS 4: SUSPENSION TRAPPING
Suspension trapping
● Groot volume SDS gebruikt (15%)
● Proteïnen worden gevangen door SDS micellen → een suspensie wordt gevormd wanneer
de buffer met 90% methanol en 1% fosforzuur in TEAB wordt toegevoegd
● Methanol breekt deze micellen open en SDS dat monomeer wordt, wordt weggewassen
● Hydrofobe regio’s van de proteïnen aggregeren met elkaar en worden zo gevangen in een quartz filter
● Via deze filter gaan eiwitten neerslaan = pellet
● Maar ze zijn nog te onderscheiden van elkaar zodat ze nog toegankelijk zijn voor proteasen
Voordeel: Het is snel, geen enzymactiviteit meer, membraan proteomics
1.2.5 BESLUIT
Shotgun proteomics
Alle voorgaande protocollen hebben het voordeel dat ze geschikt zijn voor de analyse van een brede reeks
proteïnen. Ze beperken ook de hoeveelheid startmateriaal met minimale volumes en/of staal behandelingsstappen.
Natuurlijk is de hoeveelheid startmateriaal niet altijd een beperkende factor.
Nadeel
● Steeds een proteïne equivalent van 10-100K cellen nodig om een significant aantal eiwitten te detecteren!
⇒ De keuze van het protocol kan afhangen van het monster en de onderzoeksvraag.
Single cell proteomics is het doel!
● Interessant in kankeronderzoek waar de heterogeniteit van een tumor in kaart moet worden gebracht
● Er is natuurlijk een wisselwerking tussen de hoeveelheid startmateriaal en de diepte van het proteomisch
profiel (en info over proteoforms)
● Een kleiner start materiaal zal resulteren in minder interferenties (bijv. lipiden)
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper biomedicalscientist2022. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €15,49. Je zit daarna nergens aan vast.
