Samenvatting
samenvatting methoden 3: bmw3 KUL
- Instelling
- Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
volledige samenvatting van de lessen methoden in het biomedisch onderzoek semester 1 jaar 3, KULeuven
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 84 pagina's
Voorbeeld 4 van de 84 pagina's
In winkelwagen
Voorbeeld van de inhoud
METHODEN:THEMA 2: DNA
DNA SEQUENCTIEBEPALING :
De novo sequencing = ongekend genoom v bv nieuwe organismen/soorten, gedeeltelijk of volledig
Resequencing = seq v individu tov referentiegenoom, verschillen tss individuen (mutaties, klinisch)
Sequentiebepaling als teller = aant DNA molec
• Whole genome seq = WGS = het gehele genoom
• Whole exome seq = WES = enkel de coderende stukken/ exonen
• Targeted seq = specif gewenste regio
• Transcriptoom = RNA -> cDNA
1ST GENERATION SEQUENING :
Maxam en Gilbert = chemische klievingsmethode
• Differentiele chem klieving v NZ in 4 # reacties + scheiding volgens lengte (elektroforese)
• 4 tubes : C + C/T + G + G/A
• Nadeel = relatief korte fragm + niet volledig 1duidig/specifiek
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
• Template/matrijs = clone of PCR amplicon
• Polymerase + primer + mengsel 4 dNTP (≠2’OH) + ddNTPs (≠2’OH + 3’OH)
o Polymerase = thermostabiel + knn ddNTP en dNTP inbouwen zonder onderscheid
o Primer = tegen plasmide want fragm hierin of tegen pcrprimer
• Ketenterminatie na inbouw v fluor gemerkte ddNTP
• Gelelektroforese
o Phred score Q = -10log(P) = 1/Q is de kans op een fout
o Liefst Q = 30 = accuraatheid van 99,9% = 1/30 fout
• Nadeel = beperkt tot 500nt + moeite met herhalingen
o Veel G of C : 3Hbruggen = moeilijk los te komen en vormt lussen
▪ Fragment wordt kleiner dan oorspronkelijk is, sneller door scheiding
o Grotere betrouwbaarheid = reactie zowel met reverse als forward primer
Enorme impact:
• Techn ontwikkeling v sequencen: automatisering (↓kost + ↑seqdata) + aanpak
• Grote ontwikkeling v bioinformatica
• Visie op delen v data (open science, data)
• Andere methoden want nu bijna volledige seq beschikbaar
• Biol kennist: vergelijkende genomics (inzicht in evolutie, genetische verschillen,..)
1
,Nieuwe uitdagingen:
• Volledige seq (telomeer-telomeer)
• Meer genoom sequenecn v meerdere species
• Meer indiv humane seq
• Persoonlijke genoomseq v iedereen → personalized precision medicine
o Kennis v DNA volgorde en SNPs: diagnose, prognose, preventie
o Farmacogenetics: voorspellen hoe mensen op medicijnen reageren
o Inzicht op complexe multifactoriele aandoeningen (kanker)
o Therapie op maat
Probleem sanger sequencing = throughput + kosten
2D GENERATION SEQUENCING:
= next generation sequencing / short read NGS = massief parallel sequencen v clonaal in vitro
Doel = veel hogere throughput aan veel lagere kost → massale DNA seqbepaling
Richtdoel = 1 humaan genoom op 1 toestel per dag voor 1000 dollar per genoom
Ontwikkeling met 3pijlers:
• Parallele detectie : cluster = kopien v DNA template + clonale in vitro amplificatie v template
o Duizenden-miljoenen kopien v DNA template per cluster
o Multiplexing: vele clusters tegelijk
• Miniaturisatie v reacties (picoliters)
• Integratie vh proces: alles in 1 stap, directe detectie
Stap 1: aanmaak DNA library
= fragmentenbank = verzameling vd te sequencen templates
• Whole genome sequencing
• Whole exome sequencing / targeted sequencing : aanrijking door hybridisatie aan probes
o Hybridiseren op beads of array met oligont complementair aan exonseq
o Ofwel PCR: genomisch DNA met pool v PCR primers tegen alle exonseq en dus enkel
deze amplificeren en vervolgens sequencen
• Mate pair libraries
• Amplicon sequencing; PCR amplicons
• cDNA library (RNA sequencing)
o tellen v hvl bepaalde sequentie tot expressie komt
1. input DNA kwaliteitscontrole : hvlh + concentratie + zuiverheid (260/230 en 260/280) + integriteit
2. random fragmentatie: sonicatie, nebulisatie (verneveling), DNAse I
2
,3. end repair = blunt ends maken
• T4 DNA polymerase + klenow fragment: 5‘-3‘: polymerase / 3‘-5‘: exonuclease = proofreading
• T4 polynucleotide kinase: 5’ uiteinde fosforyleren
• Taq polymerase : 3’ non-template A aanhechten
4. adaptoren aanhechten:
• Nodig voor PCR primers + sequencing primers + eventueel barcodes
• Ligatie met fragm uiteinden (sticky end met 3’ A overhang of blunt-end)
• Selectie fragm met 2# adaptoren
• Enkele pcr cycli: fragm met adapters amplificeren
Selecteren fragmenten met 2# adaptoren:
• 2 soorten adaptoren : 1tje = gebiotinyleerd + 1tje niet
o Enkel dus fragm nodig met 2# adaptoren = aan 1 kant gebiotinyleerd
• Bead met streptavidine binden de adaptoren met biotine
o Juiste fragm binden met 1 kant aan bead
o Fragm met 2 adapt met biotine binden met 2 kanten + vormen lus
o Fragm met 2 adapt zonder biotine binden gwn niet
• Denaturatie : hierdoor lost fragm aan 1 kant v bead waardoor de juiste fragm nu ook lossen
Alternatief = tagmentatie : fragmentatie + adaptors aanhechten in 1 stap
→ transposase enzym met dubbele activiteit: knipt + voegt adaptors toe
→PCR cycli met toevoeging extra barcodes aan adaptors
5. size selection : gewenste lengte selecteren = niet te lang (niet seq) + niet te kort (adaptordimeren)
• Agarose gel elektroforese : gewenste lengtes uitsnijden + opzuiveren alcoholprecip
• Magentic beads dat DNA bindt : verhouding bepaalt lengte
o Kleine hvlh beads: bindt enkel lange fragm → beads capteren en wegdoen
o Grotere hvlh beads: bindt de middellange fragm → beads capteren + vlst weg
o Spelen met verhoudingen voor gewenste lengte + gebruikt platform
6. kwaliteitscontrole :
• Gewenste lengte + concentr inserts controleren + gewenste verhouding voor poolen libraries
• Capillaire elektroforese
3
, Stap 2: klonale in vitro amplificatie
= simultane, gescheiden amplificatie v miljoenen fragm niet in bacterie maar vaak met PCR
Emulsie PCR:
• Beads met PCR primers zullen de fragm vd fragmbank binden
o 1 fragm bindt met 1bead en amplificatie gebeurt op bead via PCR
• Beads = hydrofiel : waterlaag met alle reagentie voor reactie
• Beads gescheiden door olie = olie-emulsie:
o kleine waterdruppels in olie met elke druppel een reactievat
o 1000den aparte reacties in 1 buisje
o 1000den kopien v zelfde DNA molec gebonden op 1 bepaalde bead
• Beads met DNA fragmenten isoleren vd beads zonder DNA fragm
o 2de soort grotere beads met primer die alle beads capteren met fragm
o Densiteitscentrifugatie om deze te scheiden v elkaar
Solid phase bridge amplification:
• Vast oppervlak met oligont/PCR primers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Door brownse beweging vormen de fragm lokaal bruggetjes
o Buigen af op korte afstand en binden met adaptor aan andere primer in buurt
o Zo aanmaak v complementaire streng en kan dit zich telkens herhalen
o Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec op 1-2 µm spot
Solid phase template walking (wildfire):
• Vast oppervlak met oligont/PCRprimers complementair aan de adaptoren
• DNA fragm bindt primers + amplificatie via PCR
• Primer walking :
o PCRprimer seq zo gekozen dat die makkelijk lost : partiele denaturatie v dsDNA
o Het uiteinde zal dan naar naburige primer gaan op plaat en binden
o Opnieuw amplificatie via PCR
• Clusters = 1000den kopien v zelfde DNA molec
Rolling circle amplification (in oplossing):
• Specifieke adaptoren aanhangen die zorgen dat alles circuleert + bindingsplaats voor RE type 3
o Vormen v circulair DNA via ligatie
• RE 3 = endonuclease : knipt cirkel + ligeren v 2de set adaptoren
o dit wordt aantal keer herhaalt zodat we circulair dsDNA hebben met # sets v adaptoren
o 1 cirkel = # adaptoren met hiertss telkens een kort stuk oorspronk fragm om te seq
• Rolling circle amplificatie:
o Oorspronkelijke adaptor = bindingsplaats voor polymerase : start amplificatie
o Cirkel : geen stop v amplificatie + meerdere kopies
• Clusters = nanoballs = lange DNA molec met meerdere kopies v template na elkaar
o Deze hybridiseren op vaste drager
4
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper ellaherroelen. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €7,66. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 53340 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen