Samenvatting
Samenvatting methoden 2
Volledige samenvatting van methoden 2. Alle hoofdstukken worden hierin besproken buiten hoofdstuk 1 en 2 aangezien dit inleiding is. Dus H3, H4, H5, H6, H7 en H8.
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 165 pagina's
Voorbeeld 4 van de 165 pagina's
In winkelwagenVerkoper
Volgen
Voorbeeld van de inhoud
Hoofdstuk 3: RNAInleiding
DNA vs RNA
DNA RNA
Thymine (stabieler) Uracil
Deoxyribose (geen 2’OH) Ribose (wel 2’OH) —> vatbaar voor
afbraak door RNAsen
Stabiel Makkelijker modi caties
Ds Ss
Kan secundaire/ tertiaire structuur
hebben
ddNTPs bij Sanger sequencing => ook
geen 3’OH => geen ketenverlenging
(fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten
mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor
kwaliteitscontrole
lncRNA = lang (>200 nt)
siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie)
Niet coderend RNA
mRNA
DNA —> pre-mRNA —> mRNA (matuur) —>
polypeptide
Splicing = verwijderen
• Pre-MRNA (tijdelijk) = 5’cap + exonen +
intrionen + polyAstaart
• mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA
=> niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
1
,Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modi catie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
• snel werken, inviezen (vloeib. N2),
• RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
—> bij
bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of RNAlater
(voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct, buffer/water bewerken met RNAse
inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer:
Tris= amine)
Bewaring RNA
• In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar
<DNA), als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later
RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
• Niet altijd probleem
• Detectie via electroforese of RTmin controle
• DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(I) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen
DNAse
2
,RNA extractie
! vgl met DNA extractie
Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh.
startmateriaal en doel)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen,
proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium
chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden)
• Mechanische homogenisatie:
• stikstof
• Bead-gebaseerde homogenisator: beads (= kralen) in buis met cellen +
schudden => homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer: oplossing tussen
glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
• Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA
frag nodig)
3
, Isoleren/extractie RNA
= RNA uit lysaat opzuiveren (geen eiwitten, DNA,…) dmv
organisch solvent, alcoholprecipitatie of
kolomchromatogra e
Organisch solvent = Trizol = “in huis” protocol
= guanidium thiocyanaat (zuur: pH 4) – fenol – chloroform
—> detergent => cel lysis + RNAse inhibitor (=> RNA intact)
Werking:
• organische- + inter- + waterlaag met RNA (boven) => overbrengen H20 laag tube
=> alcoholprecipitatie/ kolomchromatogra e => isolatie RNA
• makkelijk, goedkoop, goede oprengst
Vergelijk DNA:
fenol – chloroform voor extractie DNA (pH=7 <> Trizol = zuur) RNA (negatief Q:
polair) altijd in H20 laag <> DNA in H20 of organische/ interlaag afh. van pH
(negatief Q/neutr.)
Alcoholprecipitatie supernatans (precipitatie = neerslag)
= idem DNA
DNA & RNA (P0 -) neerslag bij toevoegen zout (bv Na+, Na-acetaat) + alcohol
(ethanol, isopropanol)
=> Neg. DNA neutr. door Na+ (=hydrofoob)+ alcohol => neerslag uit opl. => vlokje
(bij lage conc.: lagere temp. Of drager (glycogeen) toev. => beter zichtbaar)
=> RNA/DNA pellet oplossen in water/buffer
1e organisch/kolom => DNA/RNA dan precipitatie => neerslag DNA/RNA
—> DNA extractie: RNAsen toev => enkel DNA
—> RNA extractie (moeilijker) : 1e test of contaminatie DNA, 2e DNAsen (want RNA
verlies)
Kolomchromatogra e
1e RNA (/DNA) bindt selectief silica kolom dmv zout + pH condities => rest loopt
door (!DNA niet 100%)
2e Elutie RNA door … condities
Opstelling:
lysaat in kolom (silica/anionenuitwiss.) => vloeistof door kolom (dmv centrif., Fz of
vacuüm)
Positieve eigenschappen
• eenvoudig, zeer goede zuiverheid
4
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper marthedegraeve. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €13,86. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 47561 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen