Samenvatting
Samenvatting methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024
Zelf gemaakte samenvatting op basis van eigen lesnotities en andere verkregen samenvatting
[Meer zien]Voorbeeld 4 van de 91 pagina's
Voorbeeld 4 van de 91 pagina's
In winkelwagenVerkoper
Volgen
Voorbeeld van de inhoud
Samenvatting methoden 2024Hoofdstuk 2: DNA
DNA sequentie bepaling
Evolutie
First generation sequencing
o Maxam en Gilbert = chemische klieving methode niet kennen
o Sanger
Kloneren en elektroforese
10 jaar geduurd om humaan genoom te sequencen
Heel duur
Second generation sequencing
o Next generation sequencing (NGS) en short-read NGS
Massief parallel sequencen van klonaal in vitro geamplificeerd
DNA
2 weken om humaan genoom te sequencen
Duur
Third generation sequencing
o Next-next generation sequencing en long-read NGS
Sequencen van individuele DNA moleculen
Enkele uren om humaan genoom te sequencen
‘goedkoop’
Toepassingen
De novo genoom sequentiebepaling
o Sequencen van genoom van een species dat nog nooit eerder
gesequenced is (bv corona virus) nog geen referentie beschikbaar
Resequencing
o Sequencen van genoom van een species waarvan we al een
referentiegenoom hebben kan verschillen (SNP’s en mutaties) tss
individuen zien
Sequentiebepaling als teller
o Bv transcriptomics tellen hvl van eenzelfde transcript je
tegenkomt
Whole genome sequencing (WGS)
Whole exome sequencing (WES) = coderende sequentie
Targeted sequencing specifieke gewenste regio’s
Transcriptoom eerst RNA omzetten naar cDNA
,1e generatie sequentiebepaling: Sanger
= nieuwsynthese met dideoxy-keten terminatie
Benodigdheden:
Template DNA
DNA polymerase
Mengsel van de 4 dNTP’s + fluorescent gelabelde ddNTP’s
Primer
Denatureren template DNA primer
toevoegen bindt aan DNA (bindt
aan gekende sequentie in het
plasmide (dus niet het echte DNA
template) of aan een andere primer met
een gekende sequentie) voeg mengsel
van dNTP’s + ddNTP’s toe (verhouding
dNTP’s tov ddNTP’s is groter) DNA
pol gaat dNTP’s inbouwen, totdat het
opeens een ddNTP inbouwt (deze
ontbreekt een OH die cruciaal is voor
de fosfodiesterbinding) kan dan
geen dNTP meer ingebouwd worden,
dus verlenging stopt = terminatie
Doen dit met 1000en fragmenten
tegelijkertijd krijgen dus
verschillende fragmenten van
verschillende lengtes die eindigen met
een bepaald nt met een bepaalde kleur doen dan gelelektroforese kleine
fragmentjes komen eerst van de gel en komen dus als eerst voorbij de sensor
worden zo een voor een afgelezen elektroferogram
Beperkt tot ~500 nt’s en moeite met herhalingen
Eerste 30 bp niet afleesbaar na deze 30 kunnen we 500-700 (max 1000) goede
sequenties lezen
Phred score kwaliteitsscore per base Phred score van 10 = kans op een fout
in 1 op de 10 basen die je leest accuraatheid is 90% = te weinig wilt een
min Phred score van 30 (= 99.9%)
Lage betrouwbaarheid (lage Phred) komt vaak voor in regio’s met veel
opeenvolgende G’s of C’s G en C vormen drie waterstofbruggen in hun
basenparing maakt GC-rijke regio's stabieler en moeilijker om volledig te
denatureren als we gelelektroforese doen, dan moeten de fragmenten perfect
gedenatureerd zijn, anders kunnen sommige fragmenten zichzelf terug vouwen
en lusjes vormen lijken dan korter dan dat ze eig zijn eerder van gel
verkeerd afgelezen
Kunnen ook mutaties detecteren 2 pieken in 1 niet altijd een mutatie, want
kan ook een sequencing probleem zijn (forward en reverse reactie ter
bevestiging)
,Human genome project gedaan via hierarchical shotgun sequencing en via
whole genome shotgun sequencing biedt enorme mogelijkheid voor
personalized precision medicine
Probleem met Sanger is de throughput en de kost daarom andere
technologieën nodig met hogere capaciteit en lagere kost
2e generatie sequentiebepaling: short-read NGS
Verschillende commerciële platformen zeer competitief
Gebaseerd op 4 stappen:
1) Aanmaak NGS DNA library
2) Klonale in vitro amplificatie
3) Sequencing/sequentiebepaling
4) Data analyse
Stap 1: Aanmaak NGS DNA library
Library = fragmentenbank = verzameling van te sequencen templates
Types van DNA libraries:
WGS
Mate pair libraries
WES aanrijking via hybridisatie aan probes op kolom of via PCR (primer
tegen exonen)
Amplicon sequencing PCR amplicons
cDNA library
Aanmaak:
1) Input DNA
o Kwaliteitscontrole
Zuiverheid
(spectrofotometer)
A260/280 en
A260/230 260 =
DNA, 280 = eiwitten
en 230 = organische
componenten en
zouten
Integriteit
gelelektroforese
2) Fragmentatie
a. Sonicatie, DNase I,
nebulisatie (= oplossing
doorheen hele kleine
opening duwen)
3) End repair
, a. Blunt ends maken T4 DNA-pol vult ontbrekende nucleotiden op in
de 3'→5'-richting, zodat er geen gaten meer zijn
T4 DNA-polymerase verwijdert overhangende basen (exonuclease-
activiteit) om de uiteinden volledig stomp te maken
Soms wordt hierbij ook het Klenow fragment (~ T4 DNA pol) gebruikt
b. 5’ uiteinde fosforyleren T4 polynucleotide kinase voegt
fosfaatgroepen (5'-fosfaat) toe aan de 5'-uiteinden van het DNA
Is essentieel voor de volgende stap, omdat de fosfaatgroepen nodig
zijn voor de ligatie van adapters.
c. 3’ non-templating A aanhechten Taq DNA-polymerase voegt extra
A toe aan de 3'-uiteinden van het DNA
Adapters bevatten vaak een overhangende T helpt bij specifieke
ligatie zonder verkeerde bindingen
4) Adapters aanhechten
a. Bij NGS is amplificatie stap nodig (= PCR) primers voor nodig,
maar kennen sequentie van fragmenten niet daarom adaptoren
(gekende sequentie) aan ligeren
Kunnen deze stappen ook in 1 stap doen = tagmentatie enzym gaat aspecifiek
ergens knippen in DNA hangt er ook een klein stukje DNA aan (= adaptor)
hieraan dan een andere PCR primer hangen
5) Size selection
a. Gewenste lengte van inserts selecteren
b. Kan via gelelektroforese, maar duurt lang
c. Magnetische beads waar DNA aan bindt verhouding DNA/beads
bepaalt gebonden lengte
i. Voegen eerst kleine hvlheid magnetische beads toe (de kans
dat dat gaat binden aan DNA is dus klein) de lange
fragmenten zullen er dan aan binden gooien ze dan weg en
houden het supernatans over zijn de langste fragmenten
nu kwijt
Met supernatans gaan we dit nog eens doen, maar dan met
meerdere beads de kortere fragmenten binden dan, maar
niet de aller kortste de fragmenten die we willen behouden
hangen dus nu op de beads gaan die dus capteren met een
magneet en elueren van de beads
6) Kwaliteitscontrole
a. Gewenste lengte en conc van de inserts controleren capillaire
gelelektroforese
Stap 2: Klonale in vitro amplificatie
Simultane, maar gescheiden, amplificatie van miljoenen fragmenten
Methoden om scheiding tss clusters te behouden:
Emulsie PCR
o Beads met primers fragmenten uit DNA library kunnen binden op
beads beads zijn hydrofiel (zit waterlaagje rond waar alle
reagentia voor PCR in zitten) beads zijn dus van elkaar
Dit zijn jouw voordelen als je samenvattingen koopt bij Stuvia:
Bewezen kwaliteit door reviews
Studenten hebben al meer dan 850.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet jij zeker dat je de beste keuze maakt!
In een paar klikken geregeld
Geen gedoe — betaal gewoon eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard en je bent klaar. Geen abonnement nodig.
Focus op de essentie
Studenten maken samenvattingen voor studenten. Dat betekent: actuele inhoud waar jij écht wat aan hebt. Geen overbodige details!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper dieterleemans. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €8,46. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 64257 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen
