H21: Moleculair biologische technieken in
de celbiologie
1. Analyseren en manipuleren van DNA
Gel elektroforese
= een techniek om DNA van elkaar te onderscheiden op basis van grootte
Nodig:
restrictie-enzymen om DNA te knippen in verschillende grootten
gel
o polyacrylamide voor kleine fragmenten
o agarose voor grote DNA fragmenten
elektrisch veld
buffer oplossing
ethidium bromide om DNA te labelen (zichtbaar door bestraling via UV licht)
DNA ladder: mengsel van DNA fragmenten van gekende lengte
Werking: DNA fragmenten migreren van de negatieve naar de positieve pool obv grootte:
hoe kleiner de fragmenten, hoe sneller de migratie
Pulsed-field elektroforese
= DNA fragmenten groter dan 30 kb die niet door poriën van agarose gel kunnen migreren
scheiden obv grootte
Nodig:
één elektrisch veld langs de as vd gel
twee bijhorende velden die op 60° van de as liggen
Werking: Richting van stroomveld verandert afwisselend. Hoe groter DNA, hoe trager het
duurt eerdat het DNA fragment juist is georiënteerd.
Restrictie endonucleasen
= Restrictie enzymen knippen beide strengen van dsDNA in restrictie fragmenten op
specifieke restrictie sequenties
Restrictie sites: vaak palindromisch, RS van 4 nt: kans op voorkomen 4 4en RS van 6 nt: kans
op voorkomen 46
Oorsprong RE:
geisoleerd uit bacterien (naamgeving obv bacterie + romeins cijfer)
verdediginsmechanisme van bacterie tegen bacteriofagen
knippen viraal DNA uit hun eigen bacterieel DNA (knippen bacterieel DNA niet omdat
herkenningssite van bact DNA gemethyleerd is via methylasen)
, Werking : RE herkennen specifieke sequentie en knippen obv blunt ends (beide strengen op
zelfde plaats geknipt, geen overhang vb HaeIII) of sticky ends (strengen op andere plek
knippen, 5’ of 3’ overhang => kan baseparen vb EcoRI )
Nut:
DNA knippen : normaal DNA te groot en complex om te bestuderen
RE die sticky ends creëren: nut in recombinante DNA technologie
nagaan of DNA gemethyleerd is en dus ook of gen (in)actief is (2 RE die zelfde
sequentie knippen ifv geen of wel methylering: vergelijken)
Restrictie mapping
= DNA behandelen met twee of meerdere restrictie enzymen en ze vervolgens rangschikken
op grootte door elektroforese (belangrijk: rekening houden of DNA circulair of lineair is)
Nut: beschrijft de locatie van alle restrictie sites in oorspronkelijk DNA + DNA identificeren
Southern blot analyse
= DNA fragmenten scheiden obv gel elektroforese, overbrengen naar membraan (blotten),
identificatie via probe hybridisatie en visualisatie
Nodig:
radioactief gemerkte ‘probe’ (stuk enkelstrengig DNA of RNA dat radioactief of
fluorescent gemerkt wordt)
RE
Agarose
Nylon of nitrosecellulair papier (membraan)
Werking:
1. Knippen van genomisch DNA met RE
2. Agarose gelelektroforese
3. Denaturatie van DNA (enkelstrengig maken: noodz voor hybridisatie)
4. Blotten: DNA wordt overgebracht op membraan
5. Hybridisatie: toevoegen van probe
6. Visualisatie van banden waar de probe gebonden is via Xray of UVlicht
Nut: specifieke DNA sequentie identificeren van een mengsel
Beperking: probe op voorhand kiezen
DNA klonen (recombinante DNA technologie)
= van 1 DNA molecule vele DNA moleculen maken
DNA klonen met RE en DNA ligase
= 1 DNA fragment maken van twee verschillende DNA fragmenten (verschillende
oorsprong), recombinaties die niet vrij in de natuur zouden voorkomen (ggo’s)
Nodig:
eenzelfde RE
twee DNA bronnen
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper avdkk. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,89. Je zit daarna nergens aan vast.
