Tentamen (uitwerkingen)
tentamenstof en leerdoelen uitgewerkt biotechnologie en maatschappij
- Instelling
- Universiteit Utrecht (UU)
alle tentamenstof bij elkaar. Hiermee kun je je tentamen halen.
[Meer zien]Voorbeeld 3 van de 22 pagina's
Voorbeeld 3 van de 22 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Gekoppeld boek
Titel boek:
Auteur(s):
- Uitgave:
- ISBN:
- Druk:
Verkoper
VolgenVoorbeeld van de inhoud
Hoofdstuk 3Wat zijn restrictie-enzymen, wat doen ze in de cel en waarvoor worden ze gebruikt?
Restrictie-enzymen zijn DNA knippende enzymen. In de bacteriële cel waar ze voorkomen knippen ze viraal
DNA in stukken, zodat dit zich niet kan repliceren. Ze worden o.a. gebruikt voor DNA kloning.
Wat zijn de karakteristieken van een restrictiesite en wat zijn sticky en blunt ends?
Restrictie-enzymen knippen de fosfodiester binding van DNA door. Ze knippen niet zomaar DNA en niet elk
restrictie-enzym knipt op dezelfde plek. Restrictie-enzymen herkennen een bepaalde basensequentie
(restrictiesite) waar ze knippen. Elke restrictiesite is een palindrome (de opstelling van DNA op beide strengen
is hetzelfde. Vb. 5’ A A G C T T 3’ – 3’ T T C G A A 5’).
Sticky ends zijn als het één DNA streng overhangt na het knippen;
Blunt ends zijn als het restrictie enzym de dubbele streng doorknipt.
Bedenk een eenvoudige kloneringsstrategie.
- DNA isoleren;
- Knippen DNA met restrictieenzymen;
- DNA samen met de geknipte plasmiden in één buis doen, samen met DNA ligase;
- DNA kloneert in plasmide en die repliceert zichzelf.
Wat is een plasmide en met welke technieken kan een plasmide in een bacterie worden gebracht? Een
plasmide is een stuk circulair en zelf replicerend DNA dat onderzoekers kunnen manipuleren om andere
stukken DNA te dragen en kloneren.
Bacteriën nemen plasmiden op als: de bacteriën behandeld worden met calciumchloride oplossingen, op ijs
gekoelde plasmide toevoegen en dan de oplossing langzaam verwarmen.
Een modernere versie is elecotroporatie, waarbij door kleine pulsen kleine gaten creëren in de celwanden van
bacteriën waardoor het DNA naar binnen kan.
Het eerste recombinante humane eiwit dat op de markt kwam kunnen noemen.
In 1982 kwam het eerste recombinante humane eiwit op de markt: insuline.
De eigenschappen van een plasmide kunnen aangeven
Niet alle bacteriën nemen DNA op. De verschillende bacteriën moeten geselecteerd worden.
Kan d.m.v. antibioticum selectie. De bacteriën worden dan geplaatst op agar platen met verschillende
antibiotica. De niet recombinante bacteriën zullen sterven.
Kan d.m.v. blauw wit screening. DNA wordt gekloond in het lacZ gen (codeert voor β-galactosidase;
enzym dat lactose afbreekt in glucose en galactose). Als er iets in het lacZ gen gekloneerd wordt, kan
het zijn taak niet meer goed uitvoeren. De bacteriën worden dan op een agarplaat met ampicilline
opgekweekt. Bacteriën zonder plasmide zullen niet groeien (plasmide bevat ampR, ampicilline
resistent gen). De plaat bevat ook een kleurstof (X-gal, vergelijkbaar met lactose) die blauw wordt als
hij wordt afgebroken door β-galactosidase. De recombinante bacteriën worden dus aangeduid als een
witte kolonie.
Kunnen beschrijven hoe colony hybridization wordt gedaan (zie figuur 3.5).
Colony hybridization: een bibliotheek screenen met een DNA-probe om een gekloond gen van belang te
identificeren. Het gaat als volgt:
1. Je hebt een plaat met bacteriekolonies, die gekloonde segmenten van vreemde genen bevat.
2. Deze cellen worden naar nylon overgedragen.
3. Het nylon wordt behandeld met een wasmiddel en NaOH om bacteriën te lyseren en DNA te
denatureren. Een gelabelde probe wordt daarna toegevoegd aan het nylon.
4. De probe zal hybridiseren met het gewenste gen van de bacteriële cellen.
5. Het nylon wordt gewassen om de ongebonden proben te verwijderen en daarna zal het bloot worden
gesteld aan X ray of iets anders om fluorescentie te detecteren.
6. Vergelijk de ontwikkelde film met de master plate om de kolonies met het gen te identificeren.
7. Cellen die het gen bevatten kunnen groeien in een vloeibare cultuur en verwerkt worden om
recombinante plasmide DNA te isoleren.
, Wat zijn plasmiden, bacteriofagen, cosmiden, expressie vectoren, BACs, YACs zijn, wanneer worden ze
gebruikt worden en wat is hun capaciteit m.b.t. insert size.
Vector type Max insert size Applicaties Limitaties
Bacteriële plasmide ~ 6 – 12 kb DNA klonen, eiwit expressie, Beperkte insert size, gelimiteerde expressie
vectors (circulair) subklonen, direct sequencen eiwitten, aantal kopieën beperkt, beperkte
van insert DNA replicatie naar bacteriën
Bacteriële fagen vectors ~ 25 kb cDNA, genomische en Verpakking limiet DNA insert size; gastheer
(lineair) expressie library replicatie problemen
Cosmiden ~ 35 kb cDNA en genomische libraries, Fage verpakking beperkt, niet ideaal voor eiwit
klonen grote DNA fragmenten expressie, kunnen niet gerepliceerd worden in
zoogdiercellen
Bacterieel kunstmatig ~ 300 Genomische libraries, klonen Replicatie beperkt voor bacteriën, kan niet
chromosoom (BAC, grote DNA fragmenten gebruikt worden voor eiwitexpressies
circulair)
Gist kunstmatig ~ 200 – 2000 Genomische libraries, klonen Moeten groeien in gist, kan niet gebruikt worden
chromosoom (YAC, grote DNA fragmenten in bacteriën
circulair)
Ti vector (circulair) Hangt af van het Gen transfer in planten Kan alleen in plantencellen gebruikt worden,
type Ti vector aantal restrictiesites willekeurig verdeeld, door
dat gebruikt grootte van de vector niet gemakkelijk
wordt gemanipuleerd
Hoe wordt een genomic/cDNA library gemaakt?
Soort library Hoe gemaakt
Genomic Chromosomaal DNA van bepaald weefsel wordt geïsoleerd en geknipt met een restrictie-
enzym. Zo worden DNA fragmenten geproduceerd die het hele genoom van het organisme
bevatten. Een plasmide, BAC, YAK of bacteriofage vector wordt geknipt met hetzelfde enzym
en DNA ligase wordt gebruikt om het DNA en de vector samen te binden. In theorie worden
alle DNA fragmenten in het genoom gekloond in een vector. Bacteriën worden dan gebruikt
om de vectoren op te nemen.
De nadelen zijn:
Intronen worden ook mee gekloneerd;
De meeste organismen hebben zulke grote genomen dat een gen zoeken vrijwel
onmogelijk is.
cDNA mRNA van een bepaald weefsel wordt geïsoleerd en wordt m.b.v. reserve transcriptase (RT)
gemaakt tot enkelstrengs DNA (complementair DNA, cDNA). Het mRNA is gedegradeerd,
daarna wordt DNA polymerase gebruikt om een tweede streng DNA te maken. Omdat cDNA
sequenties vaak geen restrictiesite aan het einde hebben, worden kleine, dubbelstrengs DNA
sequenties (linker sequenties) toegevoegd aan het einde van cDNA. Door de linkers kan het
cDNA in een vector worden gezet en de vector kan dan in een bacterie geplaatst worden.
Voordelen cDNA:
Het is een collectie van expressie genen, intronen zijn niet aanwezig;
Kan gebruikt worden om genen die onder specifieke omstandigheden gemaakt
worden te isoleren.
Nadeel cDNA:
Als er te weinig mRNA aanwezig is, kan er geen library gemaakt worden.
Kunnen beschrijven wat een probe is en hoe je aan de sequentie van een probe kunt komen.
Een probe is een single strengs DNA fragment dat complementair is aan een gen van interesse. Het kan
waterstofbindingen vormen aan het doel DNA om zo gekloond te worden. Proben bevatten een radioactieve
nucleotide of een fluorescente “verf” die licht geeft bij bepaalde reacties.
Waarvoor wordt een PCR reactie gebruikt, welke componenten zijn aanwezig en hoe werkt het?
PCR wordt gebruikt om DNA te verdubbelen. De benodigdheden zijn DNA, deoxyribunucleotides, buffer, DNA
polymerase en primers.
, Stap Naam Temperatuur Gebeurtenis
1 Denaturatie 94 – 96 graden Strengen DNA laten los van elkaar waardoor er enkelstrengs
DNA ontstaat.
2 Hybridisatie/ 55 – 65 graden Primers binden aan de complementaire delen van het
annealing enkelstrengs DNA.
3 Elongatie/ 70 – 75 graden DNA polymerase voegt nucleotiden toe aan het 3’ einde van
Extentie elke primer en maakt een complete streng.
Weten wat een T vector is en waarom die een rol spelen bij het kloneren van PCR producten.
Taq DNA polymerase: een soort DNA polymerase dat bestand is tegen hele hoge temperaturen.
Hoe werkt agarose gel electrophorese?
DNA wordt geplaatst in kleine putjes bovenin de gel, en een stroom wordt aangesloten. Kleine DNA deeltjes
zullen sneller naar beneden bewegen dan de grote. Ze lopen van – naar +.
Hoe werkt de sequentie methode van Sanger?
De originele methode van Sanger werkt als volgt:
Vier aparte buisjes, elk bevatten ze een vector, primer, alle vier dNTP’s, en één soort ddNTP. Als de synthese
van een nieuwe DNA streng vanaf de primer begint, voegt DNA polymerase random ddNPT in de sequentie
i.p.v. normaal dNPT, waardoor de synthese van de complementaire streng verhinderd wordt. Na verloop van
tijd zal een ddNTP in alle posities van de nieuwe gemaakte strengen zitten, waardoor een serie van fragmenten
van verschillende lengten ontstaan. In de originele Sanger techniek waren de DNA strengen gescheiden op een
dunne gel, die sequenties kan scheiden die verschillen in lengte door een nucleotide. Autoradiografie werd
gebruikt om de radioactieve sequentie fragmenten te detecteren.
De technieken FISH, Southern blotting, Northern blotting, Western blotting kunnen uitleggen.
Techniek Werking
FISH Identificeren welk chromosoom het gezochte gen bevat.
Chromosomen worden geïsoleerd uit cellen en uitgespreid over een microscopisch glaasje. Een
DNA/RNA probe met fluorescente nucleotiden voor het gezochte gen wordt toegevoegd. Ze
probe hybridiseerd en het afval wordt weggespoeld. Het gezochte gen zal nu oplichten.
Southern blotting Bepalen hoe vaak het gen is gekopieerd onder andere applicaties
Chromosomaal DNA wordt verteerd in kleine fragmenten door restrictieenzymen. De
fragmenten worden gescheiden door agarose gel electrophorese. Het aantal
restrictiefragmenten is echter vaak zo groot dat het DNA als een continue smeer van
fragmenten in de gel verschijnt. Na electrophorese wordt de gel behandeld met een alkaline
oplossing om het DNA te denatureren, dan worden de fragmenten overgedragen aan een nylon
membraan d.m.v. blotting.
Blotting: er wordt een stapel spullen op de gel gelegd waardoor die blot (vlek) produceert met
een DNA patroon gelijk aan de gel.
Daarna wordt de blot geïnduceerd met een gelabelde probe. De overige probes worden
weggewassen en dan wordt een techniek gebruikt om de probe zichtbaar te maken. Door het
aantal bands dat zichtbaar is te interpreteren, is het mogelijk het aantal kopieën van een gen te
bepalen.
Northern blotting Scheiding en blotting RNA moleculen
Western blotting Scheiding en blotting eiwitten
Kunnen aangeven waarvoor reverse transcriptase PCR wordt gebruikt.
Soms is het aantal geproduceerde RNA in een weefsel te weinig voor Northern blotting. mRNA kan niet worden
vermenigvuldigd door PCR, maar wel met reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Van het mRNA wordt cDNA
gemaakt. De cDNA krijgt dan een aantal primers die specifiek zijn voor het gezochte gen. De DNA fragmenten
worden gescheiden in gel electrophorese en de expressiepatronen worden bepaald.
Wat is qPCR (+ 2 methodes voor Q-PCR, SYBR Green en Taqman probes)?
qPCR: nieuwe applicaties in de PCR technologie maken het mogelijk om de hoeveelheid PCR product te bepalen
tijdens een experiment. Er worden primers gebruikt met fluorescente kleurstoffen en gespecialiseerde
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper romabah. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €2,99. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 79223 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen